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美国Active Motif DNA甲基化检测试剂盒

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深圳欣博盛生物科技有限公司
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产品详情

品牌: activemotif
货号: 55001
供应商: 欣博盛
数量: 大量
规格: 50 rxns
DNA甲基化是一种基本的表观遗传学修饰,在基因表达调控、发育调节、基因组印迹等方面发挥重要作用。在DNA甲基转移酶的催化下,CpG双核苷的胞嘧啶第5 位碳原子被选择性地添加甲基基团。 在人类肿瘤中,普遍发生甲基化异常的现象,由于甲基化与胚胎发育、细胞周期调控相关,因此DNA甲基化状态的变化可作为疾病诊断和预后的一个有用的指示器。

最早在1970年,重亚硫酸盐转化就被用于鉴别DNA中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶(5-mC)。现在认为在重亚硫酸盐处理过程中,5-甲基胞嘧啶(5-mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)都不会发生碱基的变化,因此这种方法不能用来区别不同的甲基化修饰。在重亚硫酸盐转化过程中,DNA首先用重亚硫酸钠处理,在高温和低pH条件下,将变性DNA(单链DNA)中的胞嘧啶转化为胞嘧啶-重亚硫酸盐衍生物,这个反应是可逆的;接下来胞嘧啶-重亚硫酸盐衍生物发生不可逆的水解脱氨基过程,形成尿嘧啶-重亚硫酸盐衍生物。最后在高pH条件下尿嘧啶-重亚硫酸盐衍生物脱磺酸基形成尿嘧啶。只有未甲基化的胞嘧啶在重亚硫酸盐处理下发生碱基变化, 5-mC和5-hmC仍然保持不变。转化处理后的DNA经PCR扩增,尿嘧啶(U)转变为胸腺嘧啶(T)。重亚硫酸盐转化示意图如下:



重亚硫酸盐处理将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶

Active motif公司的Bisulfite Conversion Kit提供优化的转化试剂、简单易用的操作步骤以及阳性对照PCR引物,简化了DNA甲基化检测的过程。整个转化可在1.5小时之内完成,转化效率高达99%。试剂盒提供转化特异性PCR引物,可用于测序前验证重亚硫酸盐转化效率。阳性对照PCR引物适用于重亚硫酸盐转化处理的人和小鼠DNA,经PCR扩增可得到220 bp的产物。
Active motif同时也提供MethylDetector™重亚硫酸盐修饰试剂盒,该试剂盒是Active motif公司最初提供的一款DNA甲基化检测试剂盒,原理和Bisulfite Conversion Kit一样,但转化时间需要5小时。



图2 Bisulfite Conversion Kit 操作流程

使用Bisulfite Conversion Kit,将目的DNA用蛋白酶K处理,加入重亚硫酸盐转化试剂和DNA变性剂,在温度循环仪中进行快速热变性。经过1.5小时的DNA转化反应,样品加入到试剂盒里的DNA纯化柱,脱盐后洗脱DNA,可用于PCR或其他的下游实验。


阳性对照转化特异性PCR引物可用于特异性扩增转化后的人和小鼠DNA

使用Bisulfite Conversion Kit处理人(A)和小鼠(B)基因组DNA,处理(Bis)和未处理(Untr)的DNA分别用阳性对照转化特异性PCR引物进行PCR扩增分析。阳性对照PCR引物专门适用于经重亚硫酸盐转化的DNA,因此会扩增出220bp的条带,而未处理的DNA没有扩增出相应条带。

产品信息
 供货商
 产品编号
 产品名称
 规格
Active Motif
 55016
 Bisulfite Conversion Kit
 50 rxns
Active Motif
 55001
 MethylDetector™
 50 rxns
Active Motif
 55003
 Fully Methylated Jurkat DNA
 10 µg
Active Motif
 55007
 Jurkat genomic DNA
 10 µg

参考文献
1.“Aberrant methylation of the PTCH1 gene promoter region in aberrant crypt foci.” by Peng L. et al. (2013) Int J Cancer, 132(2):  E18-25.
2. “Transcription intermediary factor 1γ is a tumor suppressor in mouse and human chronic myelomonocytic leukemia.” by Aucagne R. et al. (2011) J Clin Invest., 121(6):  2361-2370.
3. “Ploidy and large-scale genomic instability consistently identify basal-like breast carcinomas with BRCA1/2 inactivation.” by Popova T. et al. (2012) Cancer Res., 72(21):  5454-5462.
4. “miR-126 and miR-126* repress recruitment of mesenchymal stem cells and inflammatory monocytes to inhibit breast cancer metastasis.” by Zhang Y. et al. (2013) Nat Cell Biol., 15(3):  284-294.
5. “Cerebellum-specific and age-dependent expression of an endogenous retrovirus with intact coding potential.” by Lee K.H. et al. (2011) Retrovirology, 8:  82.

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温馨提示:不可用于临床治疗。

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BSP甲基化检测实验服务实验原理       DNA甲基化存在于大多数真核生物中,一般发生在CpG双核苷酸中胞嘧啶的5’UTR区,起调控作用。CpG的胞嘧啶大概有80%被甲基化,20%处于基因调控区的CpG岛中。BSP甲基化测序(Bisulfite Genomic Sequencing PCR)的原理通过对基因组DNA进行重亚硫酸盐处理,非甲基化的胞嘧啶被脱氨基而转变成尿嘧啶,在随后的PCR反应中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不能被脱氨基,在反应完成时被保留,我们将扩增得到的PCR产物进行TA克隆测序,就可以分析甲基化发生的具体情况。该方法实验结果准确性高,是甲基化检测的金标准。实验流程实验结果展示                   图1 目的片段PCR扩增电泳图                                               图2 菌落PCR筛选阳性克隆 图3 三样本的甲基化结果圈点图分析       图中有三个样本,每个样本含 5 个克隆测序结果,共计 15 个测序结果。每个圆圈代表一个CG位点,黑圈 代表甲基化,白圈代表未甲基化;每一行代表一个样本 TA 克隆的一个测序结果,序列中所有的CG位点情况可被被罗列,此例序列中共含有 31 个CG位点。我司还提供甲基化检测试剂盒,欢迎广大客户前来选购。甲基化试剂盒产品简介:       DNA甲基化是一种表观遗传修饰,DNA甲基转移酶(Dnmt)催化S-腺苷甲硫氨酸作为供体,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点,它在基因组中呈不均匀分布,存在高甲基化、低甲基化和非甲基化三种状态。DNA甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化对人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生发展都起到重要作用。       EpiMethyTM Bisulfite Conversion Kit 是一款用于DNA快速重亚硫酸盐转化处理的专用试剂。基因组DNA双链变性结链后,在重亚硫酸盐的作用下序列中未甲基化的胞嘧啶(C)转变成尿嘧啶(U),而甲基化的C保持不变。通过后续的各种检测手段,如MSP、BSP、HRM、Pyroseqencing及甲基化芯片等,将甲基化状态的差
DNA甲基化整体解决方案一、结合重亚硫酸盐的测序法实验流程(BSP)(Bisulfite Genomic Sequence)原理:结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后,用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应(PCR)。 PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代,而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态。该方法特点是:1. 特异性高,它能够提供特异性很高的分析结果,这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的;2. 灵敏度高,可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。                     图1 结合亚硫酸盐的测序法流程图DNA用重亚硫酸盐处理后进行PCR扩增,扩增片段纯化后连接进载体,转化大肠杆菌,过夜培养后挑单个阳性克隆进行测序。得到每个DNA分子特定区域甲基化位点的分布图。 结合重亚硫酸盐测序法技术实验流程A.DNA制备用DNA抽提试剂盒(Promega, cat. no. A1125)抽提组织,细胞培养物,石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。B.重亚硫酸盐处理C.DNA纯化用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。D.DNA脱磺基反应E.PCR扩增F.PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化,随后连接到pGEM-T EASY 载体中克隆及测序。 二、甲基化特异性的PCR实验流程     (methylation-specific PCR, MSP)原理:甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。重亚硫酸盐处理DNA后,基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。随后进行引物特异性的PCR。该方法引物设计是关键。MSP中设计两对引物,即一对结合处理后的甲基化DNA链(引物对M),另一对结合处理后的非甲基化DNA链(引物对U)。检测MSP扩增产物,如果用引物M能扩增出片段,则说明检测位点存在甲基化;若用引物U扩增出片段,则说明被检测的位点不存在甲基化(图
一、结合重亚硫酸盐的测序法实验流程(BSP)(Bisulfite Genomic Sequence)原理:结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后,用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应(PCR)。 PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代,而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态。该方法特点是:1. 特异性高,它能够提供特异性很高的分析结果,这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的;2. 灵敏度高,可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。                     图1 结合亚硫酸盐的测序法流程图DNA用重亚硫酸盐处理后进行PCR扩增,扩增片段纯化后连接进载体,转化大肠杆菌,过夜培养后挑单个阳性克隆进行测序。得到每个DNA分子特定区域甲基化位点的分布图。 结合重亚硫酸盐测序法技术实验流程A.DNA制备用DNA抽提试剂盒(Promega, cat. no. A1125)抽提组织,细胞培养物,石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。B.重亚硫酸盐处理C.DNA纯化用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。D.DNA脱磺基反应E.PCR扩增F.PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化,随后连接到pGEM-T EASY 载体中克隆及测序。 二、甲基化特异性的PCR实验流程(methylation-specific PCR, MSP)原理:甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。重亚硫酸盐处理DNA后,基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。随后进行引物特异性的PCR。该方法引物设计是关键。MSP中设计两对引物,即一对结合处理后的甲基化DNA链(引物对M),另一对结合处理后的非甲基化DNA链(引物对U)。检测MSP扩增产物,如果用引物M能扩增出片段,则说明检测位点存在甲基化;若用引物U扩增出片段,则说明被检测的位点不存在甲基化(图3)。该方法优点是:1、检测灵

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