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可诱导表达载体构建技术服务

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可诱导表达载体构建技术服务

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  • 可诱导表达载体构建技术服务
    目前,已经研究开发出了多种Tet调控表达载体系统,主要分为Tet-on系统和Tet-off系统。在进行基因功能研究中,多用Tet-on系统,而Tet-off系统基本弃用。
    百恩维生物能为您提供Tet-on诱导表达系统的载体构建服务,并且有多种表达载体供您选择:
    1. 常规的真核表达的两质粒Tet-on系统(见图1)。
    2. 百恩维生物自主开发的病毒(慢病毒、腺病毒、腺相关病毒)单质粒Tet-on系统(见图2),构建好的质粒可直接用于真核表达,也可包装相应的病毒后使用,感染效率更高,目标基因诱导表达水平更强。
    3. 病毒单质粒Tet-on系统不仅可以表达目标基因,也可用于表达ShRNA。
    4. 百恩维生物自主开发的病毒单质粒Tet-on系统,含有GFP标记基因、药筛标记(Neomycin、Puromycin),可用于构建稳转细胞株。


    ★ Tet诱导表达原理
    四环素(Tet)诱导调控表达系统的基本原理是由诱导药物(如Tet)改变调控蛋白质的构象,从而控制目标蛋白质的表达。最初的Tet诱导调控基因表达系统是以大肠杆菌Tn10转座子上Tet抗性操纵子为基础而建立的。Tet阻遏蛋白(Tet repressor protein, TetR)与Tet操纵基因(Tet operator, TetO)DNA序列有特异的亲和能力,当细胞内无Tet存在时,TetR会与TetO结合,从而阻断下游的抗性基因表达。当有Tet存在时,药物使TetR的构象发生改变,导致TetR与TetO分离,从而引起抗性基因的抑制解除,抗性蛋白表达使细菌产生耐药性。
    利用TetR和TetO特异结合的特性,目前开发改造了多种类型的Tet调控表达载体系统,但根据其表达特点可以归为两大类:抑制型系统Tet-off和激活型系统Tet-on。

    ★ Tet-off调控系统
    最早的Tet-off基因调控表达系统由调节表达载体和反应表达载体组成。调节表达载体包含一个由人巨细胞病毒早期启动子(PhCMV)启动Tet转录活化因子(tetracycline transcrip-tional activator, tTA),tTA由TetR与单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白质C端的一段转录激活区融合而成。反应表达载体由Tet应答元件(Tet-responsive element, TRE)、最小CMV启动子(minimal CMV promoter, Pmin
    CMV)及目的基因组成。目的基因位于TRE和PminCMV的下游;TRE为7次重复的TetO序列。PminCMV缺失增强子,因此在tTA未结合到TRE时,目的基因不表达;相反,当tTA结合到TRE时,VP16会使PminCMV活化从而使基因表达。当细胞内无Tet或其衍生物强力霉素(doxcycline, Dox)的存在时,tTA可与TRE结合,打开基因表达;而当Tet或Dox存在时,它们可使tTA中的TetR改变构象,则tTA将从TRE上脱落下来,使TRE中的PminCMV处于非激活状态,从而使基因表达处于关闭状态。(详见图3)
    ★ Tet-on调控系统
    Tet-on调控系统与Tet-off调控系统的区别在于其调节蛋白质为反义Tet转录活化因子(reverse tetracy-cline transcriptional activator, rtTA)。rtTA是由反义TetR(reverse TetR, rTetR)与VP16的转录活化区域融合而成。rTetR由TetR中的4个氨基酸发生突变而衍生而来的。rTetR的表型与TetR相反,在无Dox时,其不能结合TRE,导致基因表达关闭;而在有Dox存在时,其会结合在TRE上,导致基因表达开放。(详见图4)

    ★ Tet诱导调控表达系统的优点
    1. 具有低本底与高诱导倍数的特点,无诱导时目的基因表达水平低,诱导时其表达水平增高,最高诱导倍数可达10,000倍。
    2. 诱导所需的时间短,Dox为脂溶性,容易渗透细胞和组织,在加入诱导剂30分钟内即可检测到目的基因的表达。
    3. 该诱导系统是一种可逆系统,当去除诱导剂一定时间后可使该系统关闭,之后仍可通过加入诱导剂重新开启。
    4. 诱导药物为Tet或其衍生物(如Dox),安全。Tet作为一种抗生素已被人们应用了很长时间,已被广泛作为抗生素使用,是对人体较为安全的一种药物。
    ★ Tet诱导调控表达系统的应用
    Tet系统被广泛应用于动物体内和体外(细胞水平)基因功能、蛋白质功能、以及mRNA功能的研究,也用于体外基因治疗的研究。
    比如该系统已成功的用于胰岛细胞、肺组织、脑组织以及帕金森病、软骨病等基因治疗实验研究中,目前该系统也用于诱导多能干细胞(induced luripotent stem cell, iPS cell)技术中的重编程因子表达的调控。

    相关技术服务
    基因过表达载体构建
    microRNA表达载体构建
    shRNA表达载体构建
  • 可诱导表达载体构建技术服务

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