CRISPR /Cas9专家系

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简介 sgRNA活性检测
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- 服务名称：
  sgRNA活性检测
- 提供商：
  Biomics Biotech
Biomics提供多种sgRNA活性检测方法，包括SSA luciferase报告系统、Surveyor法、Q-PCR、突变点基因测序等
- SSA检测：根据客户要求检测sgRNA的活性及敲除效率，客户也可以选购我公司Precut pSG-target Cloning kit自行构建报告载体用于检测，我公司提供阳性及阴性sgRNA及其SSA report target质粒。
- 检测原理：SSA报告质粒(pSG-target)中luciferase基因被终止密码子提前终止，这种截短的luciferase没有活性。为检测sgRNA的剪切活性，将Cas9/sgRNA的靶点序列插入到终止密码子之后。在Cas9和sgRNA的作用下，靶点位置的序列被有效剪切形成DSB，细胞通过同源重组重新形成有活性的luciferase（Figure 1），通过检测luciferase的活性升高就可以反应Cas9/sgRNA的剪切活性（Figure 2）
Figure 2. Restore disrupted luciferase function via sgRNA-mediated homologous recombination

Figure 3.Increased FL/RL ratio in Cas9/sgRNA transfection cells.

Surveyor法及测序验证：
CRISPR/Cas9打靶基因后引入的突变的方式与ZFN、TALEN基本一致，都是NHEJ或是HR。因此在CRISPR/Cas9的应用中，活性检测或是突变效率的检测可以参照ZFN和TALEN方法.主要包括有:靶位点直接PCR后TA克隆测序和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法（Surveyor法）。
Surveyor法即错配酶法：靶序列经CAS/sgRNA切割后由于缺乏修复模板，将主要以非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列PCR扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶（主要是CEL1或T7E1酶）将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，即可反映出Cas/sgRNA的活性。

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