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sgRNA活性检测
Biomics Biotech
Figure 2. Restore disrupted luciferase function via sgRNA-mediated homologous recombinationFigure 3.Increased FL/RL ratio in Cas9/sgRNA transfection cells.
Surveyor法及测序验证:
CRISPR/Cas9打靶基因后引入的突变的方式与ZFN、TALEN基本一致,都是NHEJ或是HR。因此在CRISPR/Cas9的应用中,活性检测或是突变效率的检测可以参照ZFN和TALEN方法.主要包括有:靶位点直接PCR后TA克隆测序和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法(Surveyor法)。 Surveyor法即错配酶法:靶序列经CAS/sgRNA切割后由于缺乏修复模板,将主要以非同源重组的方式进行修复,或多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列PCR扩增后经变性、退火,将形成错配。错配酶(主要是CEL1或T7E1酶)将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳,比较切割条带与未切割条带的比例,即可反映出Cas/sgRNA的活性。
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陈小姐
中国国家级南通经济技术开发区常兴路76号
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