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    CRISPR /Cas9专家系统服务-sgRNA活性检测

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    CRISPR /Cas9专家系统服务-sgRNA活性检测

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      • 提供商:

        Biomics Biotech

      • 服务名称:

        sgRNA活性检测

      Biomics提供多种sgRNA活性检测方法,包括SSA luciferase报告系统、Surveyor法、Q-PCR、突变点基因测序等
      • SSA检测:根据客户要求检测sgRNA的活性及敲除效率,客户也可以选购我公司Precut pSG-target Cloning kit自行构建报告载体用于检测,我公司提供阳性及阴性sgRNA及其SSA report target质粒。
      • 检测原理:SSA报告质粒(pSG-target)中luciferase基因被终止密码子提前终止,这种截短的luciferase没有活性。为检测sgRNA的剪切活性,将Cas9/sgRNA的靶点序列插入到终止密码子之后。在Cas9和sgRNA的作用下,靶点位置的序列被有效剪切形成DSB,细胞通过同源重组重新形成有活性的luciferase(Figure 1),通过检测luciferase的活性升高就可以反应Cas9/sgRNA的剪切活性(Figure 2)
       


      Figure 2. Restore disrupted luciferase function via sgRNA-mediated homologous recombination


      Figure 3.Increased FL/RL ratio in Cas9/sgRNA transfection cells.


      Surveyor法及测序验证:

          CRISPR/Cas9打靶基因后引入的突变的方式与ZFN、TALEN基本一致,都是NHEJ或是HR。因此在CRISPR/Cas9的应用中,活性检测或是突变效率的检测可以参照ZFN和TALEN方法.主要包括有:靶位点直接PCR后TA克隆测序和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法(Surveyor法)。
          Surveyor法即错配酶法:靶序列经CAS/sgRNA切割后由于缺乏修复模板,将主要以非同源重组的方式进行修复,或多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列PCR扩增后经变性、退火,将形成错配。错配酶(主要是CEL1或T7E1酶)将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳,比较切割条带与未切割条带的比例,即可反映出Cas/sgRNA的活性。

       


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    百奥迈科生物技术有限公司

    • 联系人:

      陈小姐

    • 所在地区:

      中国国家级南通经济技术开发区常兴路76号

    • 业务范围:

      技术服务,试剂

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