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CRISPR/Cas9基因敲入
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CRISPR-Pro基因敲入小鼠
CRISPR-Pro基因敲入小鼠是利用CRISPR/Cas9基因敲入技术,针对靶基因设计、构建相应的 gRNA质粒和donor vector,通过Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重组,引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型);或将报告基因(如EGFP,mRFP,mCherry,mYFP,或LacZ等),从而可以通过报告基因来跟踪目标基因的表达;也可以用报告基因取代大小鼠本身的基因,使KO/KI同时发生。
CRISPR-Pro基因敲入小鼠包括:点突变、片段基因敲入。
点突变鼠的建系原则与流程
1、通过针对靶基因设计、构建gRNA质粒并转录为RNA,再合成含有突变位点信息的donor oligo,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子鼠;
2、F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配,获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子鼠;3、 选择来自同一只F0代鼠,敲入位点一致的F1代鼠,达到性成熟后进行同胞交配,可获得F2代鼠。对获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代鼠中25%为敲入位点一致的纯合子鼠,有50%为只有一条染色体敲入的杂合子鼠,有25%为野生型鼠。
片段基因敲入的建系原则与流程
1、通过针对靶基因设计、构建gRNA质粒和含有突变位点信息的donor vector,将以上质粒转录为mRNA后,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子鼠;
2、F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配,获得PCR鉴定基因型和测序鉴定随机插入的F1代杂合子鼠;3、 选择来自同一只F0代鼠,敲入位点一致的F1代鼠,达到性成熟后进行同胞交配,可获得F2代鼠。对获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代鼠中25%为敲入位点一致的纯合子鼠,有50%为只有一条染色体敲入的杂合子鼠,有25%为野生型鼠。
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