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    GFP/RFP慢病毒

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    GFP/RFP慢病毒

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      • 提供商:

        Cyagen

      • 服务名称:

        GFP/RFP慢病毒

      一、慢病毒的介绍
              慢病毒(Lentivirus)载体是以 HIV-1(人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别于一般的逆转录病毒,它可以有效感染分裂期和非分裂细胞,并且感染效率非常高,是传统方法的数倍甚至数十倍。慢病毒所携带的基因能够整合到细胞基因组中,并且长时间持续稳定表达,同时能够随细胞分裂稳定传递下去,因此成为导入外源基因的有力工具,是目前最受欢迎的基因功能研究工具。
              Cyagen公司采用第三代慢病毒包装系统进行慢病毒包装,第三代慢病毒包装系统由一个目的基因质粒、二个包装质粒、一个包膜质粒组成,具有更好的安全性:
       1、其基因组的3’LTR的增强子功能发生了缺失,从而形成了所谓的“自灭活”(Self-inactivation,SIN),即该病毒基因组整合到细胞基因组后,不会产生新的子代病毒,也降低了对周围基因的意外激活。
               2、去除了Tat基因,代之以异源启动子序列,这样原始的HIV基因组中的9个基因在慢病毒载体中只保留了3个(gag, pol和rev)。病毒包装必需的3个蛋白Gag/Pol, Rev, VSV-G(代替HIV-1的Env)分别独立放置在3个质粒上(pGag/Pol, pRev, pVSV-G),且互相之间没有任何同源序列,大大降低了复制型慢病毒(RCL)的产生几率。

      二、慢病毒的包装
      1、质粒信息:
              第三代慢病毒包装系统由一个目的基因质粒、二个包装质粒、一个包膜质粒组成,具有更好的安全性。
      2、包装流程:
      慢病毒包装
      慢病毒浓缩和纯化
      Cyagen 公司采用新技术对慢病毒进行浓缩、纯化后,慢病毒表现为:
      • 活力强,转染率高,最大化的减少药筛及挑克隆繁杂工作。
      • 纯度高,浓缩过程中去除了细胞碎片及较大蛋白,避免了实验动物和细胞的毒性反应及免疫反应。
      • 应用广泛,能感染所有的哺乳动物细胞。


       
      三、慢病毒的滴度检测方法

              Cyagen公司的慢病毒产品使用定量PCR方法进行滴度检测,定量PCR方法检测慢病毒滴度的原理是检测整合到细胞基因组的慢病毒基因(WPRE)总拷贝数,采用慢病毒基因(WPRE)标准品和内参基因标准品能精确的测量单个细胞的慢病毒基因拷贝数,从而计算出慢病毒滴度。通过这种方法检测出来的慢病毒滴度为实际滴度,区别于ELISA方法、RNA方法检测的物理滴度。这种方法比FACS方法和药筛方法应用范围更广,能检测不带抗性基因及示踪基因的慢病毒载体。

      TIPS:
      精确定量,排除主观人为因素的影响;有效缩短用于滴度检测的实验周期;滴度测定值为实际功能滴度,可有效反应真实情况。

       
      四、慢病毒转染细胞的实例图

      Fig 6. 慢病毒对照转染各种细胞48h图, 200x。 (A-B)为GFP Lentiviral Control (Cat.No. LV-EGFP-0101) 转染OriCellTM C57BL/6小鼠胚胎干细胞 (Cat.No. MUBES-01001), 转染率为100%; (C-D)为RFP Lentiviral Control (Cat.No. LV-DSRD-0101)转染 OriCellTMF344大鼠间质干细胞 (Cat.No. RAFMX-01001), 转染率90%左右;(E-F)为 GFP Lentiviral Control (Cat.No. LV-EGFP-0101)转染肿瘤细胞CHO,转染率90%以上。

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