10x 单细胞转录组测序

 

单细胞转录组测序（Single cell RNA sequencing），简单来说，就是在单个细胞水平上，对转录组水平进行测序分析的技术。传统测序方法通常在多细胞基础上进行，得到的是一堆细胞中信号的均值，丧失了细胞异质性（细胞之间的差异）的信息。而单细胞测序技术能够揭示单个细胞的基因表达状态，解决了传统测序无法解决的细胞异质性问题。单细胞转录组测序技术的不断发展将在精准治疗、生物医学研究和临床应用中发挥越来越重要的作用。单细胞测序技术正在推动生物学领域向前发展，为个性化预防和治疗提供了技术支持。

 

应用领域

①肿瘤研究：单细胞测序技术帮助揭示肿瘤内不同细胞类型的异质性，探索肿瘤微环境中细胞的转录组表达和免疫功能。

②发育生物学：通过单细胞测序，我们可以追踪胚胎发育过程中不同细胞的基因表达变化，理解细胞分化和发育。

③神经科学：研究单个神经元的转录组可以帮助理解神经系统的功能、神经退行性疾病以及神经元之间的相互作用。

④免疫学：单细胞测序技术有助于研究免疫细胞的异质性，例如T细胞、B细胞和巨噬细胞的功能状态。

⑤微生物学：通过单细胞测序，我们可以深入了解微生物群落中不同细菌、病毒和其他微生物的基因表达。

 

技术服务优势

①高通量和高精度：单细胞测序技术能够以最小的样本起始量进行无偏差的高通量研究。每个样本可以分析数千个细胞，同时探索单个细胞的转录组变化。

②解析细胞异质性：不同组织、器官或系统中的细胞存在异质性。避免了混合样本的均质化，能够深入探索健康生理和疾病异常下的细胞状态。

③功能状态研究：可以推断和发现新的细胞类型，从而更好地理解细胞间的协同运作方式。它在研究组织异质性、肿瘤细胞异质性、免疫和神经科学等领域发挥着重要作用。

 

技术原理

利用10x Genomics Chromium微流控系统，实现通过序列标签区别不同细胞和转录本。微流控系统通道直径很小一次通过一个细胞。首先在通道中加入带有标签的凝胶微珠，单个细胞和单个带有标签的凝胶微珠结合，二者被加入的油包裹到一个液滴中，形成油包水体系。凝胶微珠上带有大量包含凝胶微珠特异性Barcode序列、分子特异性UMI序列和polyT序列的引物序列，将细胞裂解后mRNA分子被引物序列中的polyT捕获，扩增后形成携带有Barcode和UMI序列的cDNA，即可实现将不同细胞来源的不同mRNA分子加上标签。

 

Gel Beads（凝胶微珠）

Gel beads在转录组测序中的作用是捕获细胞中的mRNA，每个微珠表面携带有几十万个Oligo序列（如下图）。Oligo dT序列由4个部分组成：read1用于上机测序；第二段是16bp 的10x barcode序列,每一个Gel Beads都携带不同的barcode , 可标记获取的mRNA都来自于哪一个细胞；第三段UMI长度为12bp, 可以将转录本序列进行绝对定量，避免扩增产生偏好；第四段是30bp的ployT，用于捕获有ployA尾的转录本。

捕获及建库

对制备好的单细胞悬液先进行质检，质检合格后与Gel Beads和油分别加入到Chromium Chip G的不同通道，经由微流体“T字”交叉系统形成GEM。接着细胞裂解，Gel Beads自动溶解释放大量引物序列，与带有PolyA的mRNA进行逆转录，生成带有10x Barcode和UMI信息的cDNA第一链。

GEM破碎后，磁珠纯化一链cDNA，并进行PCR扩增，得到稳定的cDNA。然后将扩增后的cDNA进行酶切片段化，筛选合适长度片段，通过末端修复、加A、接头连接Read2测序引物，构建含有P5和P7接头以及双端index的3端表达谱文库。

 

部分分析结果

 

应用案例：借助scRNA seq揭示不同“中风”类型的反应性胶质细胞介导的突触吞噬作用

卒中（Stroke）又称“中风”，包括缺血性卒中（ischemic stroke ，IS）和出血性卒中（hemorrhagic stroke，HS）。该研究发现小胶质细胞/巨噬细胞和星形胶质细胞在IS小鼠中过度激活从而吞噬神经突触；而在HS小鼠中只有小胶质细胞/巨噬细胞过度激活介导突触吞噬，星形胶质细胞无明显作用。此外，借助条件性基因敲除小鼠发现，缺血性卒中14天后，在小胶质细胞/巨噬细胞或星形胶质细胞中特异性敲除MEGF10或MERTK，导致反应性胶质细胞介导的神经突触吞噬减少。同样地，在出血性卒中后14天，MEGF10KO或MERTKKO小鼠小胶质细胞/巨噬细胞介导突触吞噬能力下降。

为了进一步探究缺血性卒中和出血性卒中细胞群的表达变化，借助单细胞测序进行分析。与缺血性卒中相比，出血性卒中后介导神经突触吞噬的星形胶质细胞群数量明显降低。Astrocytes的细胞亚群subcluster3的细胞数量明显降低，且subcluster3细胞亚群主要发挥吞噬作用。

借助疾病动物模型、条敲鼠、免疫荧光染色、TEM、病毒载体、单细胞测序等技术手段研究证明了小胶质细胞和星形胶质细胞可通过MEGF10和MERTK这两个关键分子吞噬神经突触，导致神经突触丢失和神经环路破坏，最终造成神经功能障碍。而抑制胶质细胞吞噬能显著增加损伤周边区的神经突触密度，减轻小鼠脑损伤，改善小鼠的运动和认知功能。鉴于小胶质细胞和星形胶质细胞在不同卒中类型中介导突触吞噬的差异性，针对不同脑卒中病理阶段，开发精准有效治疗策略，将大大促进脑血管病的预后。

                           图1 缺血性脑卒中与出血性脑卒中星形胶质细胞吞噬相关基因表达差异（PMID：34836962）