试剂和材料的制备:
A、NK细胞扩增培养基
使用无菌技术制备NK细胞扩增培养基(NK细胞基础培养基+NK细胞扩增补充剂)。
1、在室温(15 - 25°C)或在2 - 8°C下解冻NK细胞扩增补充剂;彻底混合。
注意:如果不立即使用,请放置并保存在-20°C。不要超过补充剂的保质期。等分解冻后,立即使用。不要重新冷冻。
2、在9ml的NK细胞基础培养基中加入100 μl的NK细胞扩增剂;彻底混合。
注意:如果不立即使用,请将NK细胞扩增培养基在2 - 8°C下保存4周。
B、NKGRO NK细胞扩增预包被材料(1×)
采用无菌技术制备 NK细胞扩增预包被材料(1×)(NK细胞扩增预包被材料+ D-PBS[不含Ca2+和Mg2+])。下面的例子是制备10 ml的涂层材料。如果准备其他体积,请进行相应调整。将100 μl NK细胞扩增预包被材料加入9.9 ml D-PBS(不含Ca2+和Mg2+)中。彻底混合并立即使用。
使用过程介绍
培养天数 |
0 |
3/4 |
7 |
10/11 |
14 |
操作方法 |
接种NK细胞 |
添加培养基 |
传代 |
传代 |
收获细胞 |
使用说明
请在使用试剂盒之前阅读完整的使用说明。为了达到更好的使用效果,请遵循推荐的补料和推荐的时间表。然而,如果细胞密度没有过度融合和达到合格的细胞浓度,培养基没有改变颜色,时间表可以在每一步调整+/-一天。
推荐使用的预包被材料,培养基和接种密度的数值(以96孔板为例)
培养容器规格 |
添加细胞扩增预包被材料体积/孔 |
添加培养基体积/孔 |
接种细胞密度(cells/mL) |
接种细胞数(个) |
96孔板 |
100 μl |
100 μl |
1×106 |
1×105 |
24孔板 |
500 μl |
500 μl |
1×106 |
5×105 |
第0天
1、每孔加入100 μl NK细胞扩增预包被材料。
2、室温(15℃~25℃)孵育2小时。
3、从96孔板中吸出预包被材料之后,用PBS清洗。清洗之后PBS也要抽吸出去。
4、加入NK细胞扩增培养基,每孔100 μl。
5、加入NK 细胞1×105个/孔。
6、37°C和5% CO2孵育3或4天。
第3/4天
7、每孔加入100 μl细胞培养基;37°C和5% CO2孵育3或4天。
第7天:收获NK细胞和传代
8、按照步骤1 - 3准备一个新的24孔板。
9、在孔中轻轻上下摇晃孔板,确保所有细胞都处于悬浮状态,然后将细胞悬浮液转移到合适的试管中。用1 ml PBS冲洗孔,也转移到试管中去。
10、1200 r/min离心10分钟。抽吸上清,将细胞颗粒重悬于 NK细胞扩增培养基中。
11、使用台盼蓝和血细胞计进行活细胞计数。
12、将4×104个细胞加入1ml的 NK细胞扩增培养基制成2×105cells/ml的细胞悬液。
培养容器规格 |
添加细胞扩增预包被体积/孔 |
添加培养基体积/孔 |
接种细胞密度(cells/ml) |
接种细胞数(个) |
96孔板 |
100 μl |
200 μl |
2×105 |
4×104 |
24孔板 |
500 μl |
1 ml |
2×105 |
2×105 |
13、96孔板每孔加入200 μl的细胞悬液。
14、37°C和5% CO2孵育3或4天。
第10/11天:收获NK细胞和传代
15、重复8~14步骤。
16、37°C和5% CO2孵育3或4天。
第14天:收获NK细胞
17、在孔中轻轻上下摇晃孔板,确保所有细胞都处于悬浮状态,然后将细胞悬浮液转移到合适的试管中。用1 ml PBS冲洗孔,也转移到试管中去。
注意事项:
1、当用 NK细胞扩增预包被材料(1×)涂覆培养皿时,如果需要,可以在2 - 8°C下过夜或在室温(15 - 25°C)下孵育2小时。
2、NK细胞扩增因供者而异。上面概述的方案是优化的平均NK细胞样本。由于一些供体NK细胞可能比预期的更快或更慢,因此建议仔细监测培养情况。调整收获和传代步骤,以确保细胞不会过度生长,可能会提高性能。