His标签纯化常见问题解析

His标签是由6个组氨酸首尾相连组成的短肽，通常连接在蛋白质的N端或C端，能够用于重组蛋白的分离纯化。由于His标签分子量小，其对重组蛋白的结构及生物活性几乎没有影响。His抗体能够特异性识别His标签，可以用于定性定量检测His融合蛋白的表达、细胞内定位等。

His标签蛋白纯化是原核蛋白表达纯化中常用的方法，其特点主要表现在以下几个方面：

（1）N-端的His标签与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达。

（2）采用IMAC方法纯化His标签融合蛋白，操作更加简便快捷。

（3）His标签可与其它亲和标签构建双亲和标签。

（4）His标签能应用于多种表达系统，且纯化条件温和。

（5）相比其他标签，His标签的免疫原性较低，可直接将纯化的蛋白注射入动物体内进行免疫并制备抗体。

（6）His标签融合蛋白适用范围较广，既可在非离子型表面活性剂存在条件下纯化，也可在变性条件下进行纯化。

（7）His标签应用广泛，除纯化多组氨酸标签重组蛋白之外，还可应用于ELISA、Western Blot、pull down、凝胶染色和荧光标签等。

虽然His标签纯化系统具有诸多优点和便利，但实验也会出现一些常见问题，影响到最终蛋白的表达和纯化，这时就需要采取一些适当措施解决这些问题。下面就列举一些His标签蛋白纯化的常见问题，并针对具体问题提出解决方案和优化策略。

His标签纯化常见问题及优化策略 1．His标签蛋白不挂柱：

①金属离子的选择：

如果选择的是Ni2+或Co2+可以换成作用力更强的Cu2+或Zn2+。

②超声功率：

超声功率太小可能导致蛋白没有释放，功率太大又可能会使蛋白炭化，所以要调节超声功率到合适水平，并且在超声之前加入溶菌酶。

③缓冲液条件：

适当提高缓冲液PH、降低咪唑浓度或改变盐浓度都可能提高His标签蛋白的挂柱能力。

④His标签是否丢失：

通过Western Blot或Anti-His的抗体检查His抗体是否表达。

⑤标签暴露情况：

蛋白表达过程中，标签暴露可能不充分，可加入适量变性剂（脲、盐酸胍）使标签充分暴露。若不能采用变性条件纯化，就只能通过增加His标签长度或改变His添加的位置来解决。

2．His标签蛋白挂柱后洗脱不掉：

①洗脱条件太温和：

可以通过降低pH和增加咪唑浓度找出最佳的洗脱条件。但PH低于3.5可能会导致Ni2+脱落，这时候就需要采用咪唑竞争性洗脱法。

②蛋白沉淀在柱子上：

尝试减少上样量和孵育时间，避免蛋白沉淀。

③非特异性吸附：

添加非离子去污剂洗脱缓冲液或增加NaCl的浓度。

3．杂带较多：

①超声条件与温度：

检查超声破碎的条件是否太剧烈或温度控制是否合适。

②蛋白酶的影响：

蛋白酶可能会导致部分蛋白被降解，可加入蛋白酶抑制剂。

③洗脱条件：

采用咪唑竞争性洗脱，此外在咪唑洗脱前增加0.5M PH=5的醋酸缓冲液洗脱，在平衡缓冲液中添加0.5%吐温或Triton可以避免因为疏水作用导致的非特异性吸附，这样可以明显减少电泳杂带。

④蛋白相互作用或形成聚合体：

蛋白相互作用或者形成聚合体可能会导致杂带增加，前者可以通过添加表面活性剂和增加离子强度得到改善，后者可以在缓冲液和样品中加入1-2mM巯基乙醇避免，并且选择NTA琼脂糖凝胶。

4．蛋白纯度不够：

①金属离子结合能力：

纯度不够可能是由于宿主蛋白中一些含有His的天然蛋白结合在柱子上，可以通过更换结合能力较弱的Co2+，使含有His的杂质蛋白无法结合而标签蛋白可以结合。

②洗脱条件：

寻找最合适的结合洗脱条件，将标签和杂质尽可能分开。

③双标签纯化：

可以在重组蛋白上同时添加His标签和其他标签（如StrepⅡ ），通过两步亲和层析，提高目的蛋白纯度。

④多步骤纯化：

在亲和层析后可进行凝胶过滤层析或离子交换层析，根据目的蛋白大小或带电荷等性质将蛋白和杂质进一步区分开。