CRISPR/Cas9基因编辑

RISPR/Cas9技术极大方便了基因编辑的操作。利用CRISPR/Cas9进行基因编辑，其基本原理为：第一步先对需要编辑的位点进行切割，造成DNA断裂；第二步用细胞的DNA修复机制对DNA断裂点进行修复。从而产生需要的突变结果。

目前主要有两种方式进行基因敲除：通过邻端接合反应敲除目的基因或者通过同源重组敲除目的基因。邻端接合反应的优势在于只需要对DNA切割后，细胞自身就能修复。由于不需要重组载体，只需要转入Cas9蛋白和sgRNA就能开始实验，启动非常快速。同源重组法需要在导入Cas9蛋白和sgRNA的同时，转入同源重组的修复。

（一）邻端接合基因敲除 1、优点：

1） 只需构建一个载体就能开始实验，启动快速。

2） 实验设计简单。

2、缺点：

1）突变随机，鉴定工作量大。

2） 基因功能缺失对细胞生长有影响时，很难获得敲除成功的细胞。

3、原理：

4、实验流程：

（二）重组法基因敲除 1、优点：

1）抗性基因稳定整合到基因组中，阳性率很高。

2） 筛选较为容易。

2、缺点：

1） 实验设计较复杂。

2） 需要同时构建基因敲除载体和重组修复载体，实验启动慢。

3、重组法基因敲除原理：

4、实验流程：

（三）重组法定点突变

定点突变是对指定位置的一个或者数个碱基进行精确编辑。定点突变的目的不是基因功能缺失，而是基因功能的改变。

与重组法基因敲除相比，定点突变要求编辑后基因组上不能残留抗性基因。因此有一定可能未能正确突变的细胞在筛选中存活。定点突变基因编辑的难度要大于基因敲除。

1、定点突变原理：

2、实验流程：