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柠檬酸合酶(CS）测试盒（可见

分光光度法）

价格 ￥2180
品牌 XKBio
货号
产地上海
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更新日期 2023年10月19日

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- 数量：
  100
- 英文名：
  /
- CAS号：
  /
- 保质期：
  3个月
- 供应商：
  上海晅科生物科技有限公司
- 保存条件：
  详见说明书
- 规格：
  50管/24样
柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）试剂盒说明书
                                  分光光度法50管/24样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。

测定原理：
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在 412nm处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

试剂组成和配制：
试剂一：液体50mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：液体10mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：液体1mL×1支，-20℃保存；
试剂四：液体55mL×1瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1支，-20℃保存，临用前加入2.4mL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；

样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
- 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
- 将匀浆600g，4℃离心5min。
- 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
- 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS（此步可选做）。
- 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体CS测定。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）在试剂五中加入1.2mL无水乙醇和26mL试剂四，混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
（2）测定管：在EP管中加入40μL样本、880μL试剂五和40μL试剂六，混匀，37℃反应15min后立即测定吸光值A1。

（3）对照管：在EP管中加入40μL样本、880μL试剂四和40μL试剂六，混匀，37℃反应15min后立即测定吸光值A2。
（4）计算ΔA=A1-A2，每个测定管设一个对照管。

CS活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V样÷V样总）÷T=23.8×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V样÷V样总）÷T=0.0475×ΔA
V反总：反应体系总体积，9.6×10^-⁴ L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，15 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
温馨提示：不可用于临床治疗。
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