Western Blot（WB

服务介绍： 蛋白质免疫印迹法 (Western Blot ) ，简称WB ，是指通过SDS-PAGE胶将不同分子量的蛋白质分离开，然后将目标蛋白转移到载体(PVDF)膜上，利用抗原抗体的特异性结合，用特异性的一抗结合目标蛋白，用HRP标记的二抗结合一抗，再加以ECL发光液显色，检测组织或者细胞内某种或者某些特异性蛋白质的表达。蛋白质免疫印迹是做蛋白质分析的一种常规技术，常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析，还可以用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。

蛋白提取 ➊ 细胞样品在提取前需要使用PBS清洗两遍，以减少培养基对样品的干扰，悬浮细胞可500Xg低速离心后收集进行蛋白提取。贴壁细胞可在培养器皿中直接进行蛋白提取。蛋白提取前建议进行细胞计数，以确定提取中添加裂解液的比例，得到最佳提取效率。 ❷ 组织样品在提取前也需要用PBS清洗，一些含血量丰富的组织，建议使用红细胞裂解液去除红细胞，以避免血液中IgG对后续实验的影响。 ❸ 为了防止蛋白降解、去磷酸化，各种蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂都是必须的。 ❹ 在提取蛋白的时候仅仅靠裂解液有时候也不能达到完全抽提的效果，有条件的话，可以对抽提悬液进行超声破碎处理；超声的时候，因为超声发热损伤蛋白，需要把要超声的样本放到冰水混合物里。 ❺ 此外如果没有裂解buffer，可以用1×SDSloading buffer代替来抽提蛋白，其效果类似于SDS裂解液，不过抽提后的样本不能进行浓度测定。 ❻ 蛋白煮沸变性一般是95-100°C，5-10min，水浴锅煮沸时，可用带夹EP管防止EP管盖弹开，使水浴锅内的水进入而使样品废掉。

印迹膜封闭 ➊ 脱脂奶是最常用的经济配方。 ❷ 脱脂奶粉不能与生物素化的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素；建议使用BSA。 ❸ 分析磷酸化蛋白须用BSA。脱脂奶粉含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化;也不适用于碱性磷酸酶(AP)检测系统。 ❹ 如果用辣根过氧化物酶(HRP)检测系统，封闭液不应加叠氮-钠(NaN3)，因为叠氮-钠对辣根过氧化物酶（HRP）有灭活作用。 ❺ 如果用二抗抗体是碱性磷酸酶(AP)标记的检测系统，可使用酪蛋白封闭，同时须选择TBS缓冲溶液，不可使用PBS缓冲溶液，因为PBS缓冲溶液干扰碱性磷酸酶。

显影成像 ➊ 建议使用高信号强度、高灵敏度、高稳定性的ECL化学发光试剂。 ❷ 显影液务必覆盖整个印迹膜。 ❸ 显影液A液和B液吸取过程中必须更换移液器枪头，避免相互污染失效。 ❹ ECL工作液需避免强氧化剂如次氯酸-钠等对工作液的影响。 ❺ 须确保试剂瓶干净，无微生物或其它试剂污染。为了小伙伴们的安全，请穿实验服并佩戴一次性手套。

送样运输要求： 
1、组织新鲜标本，100mg以上（绿豆大小）；
2、细胞数106离心收集沉淀，绿豆大小。
3、全程干冰运输。

注意事项：

1、有趋势，不需做预实验。
2、没有趋势，要求做预实验。
3、WB检测里包含了蛋白提取。
4、实验结束，返还胶图。
5、一个指标只能跑一张膜