• 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
• 本产品仅限于专业人员的科学研究用途，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

FilmCLICK Tech. 是天九再生医学研发的基于共价偶联的膜特异性专有标记技术，该技术具不聚集、不弥散、不二次标记的特点。根据外泌体膜与细胞膜的结构差别，天九分别开发出针对外泌体膜的EvLINK 系列染料与针对细胞膜结构的CellLINK系列染料，标记后被激发可以发出稳定、明亮的绿色/红色荧光。

外泌体的细胞摄取实验中有两个难以回避的问题：

1）聚集造成的假阳性：常规亲脂性染料在水溶液中自发形成染料聚集体或团块，难以吹散，聚集染料的荧光信号极易与外泌体混淆，引起观测结果的假阳性；

2）二次标记造成的假阳性：由于外泌体膜与细胞膜结构的相似性，常规染料标记的外泌体在被细胞摄取后一旦脱落，会二次标记细胞膜带来非外泌体荧光信号。

EvLINK+CellLINK双染策略，解决外泌体摄取实验假阳性的完美方案。

99%标记率，不二次标记的膜特异性染料

基于FilmCLICK Tech.技术开发的EvLINK 具有极高的特异性和高于99%的标记率，且一旦EvLINK从外泌体表面脱落，其活性基团即刻变性失活，掉落的EvLINK 仅发出无法被检测的微弱荧光，不再对膜结构二次标记，避免染料二次标记带来的假阳性。Fig.1分别为EvLINK 对外泌体的标记率及化学模拟EvLINK 活性基团变性后对外泌体的标记率：

Fig.1 （a）EvLINK 505 对外泌体的标记率与（b）化学模拟脱落的的EvLINK 505 结构对外泌体的标记率

不聚集、不弥散的“真实”染色

EvLINK 通过共价偶联外泌体膜而实现标记发光，避免了两大“假阳性”：

1）非亲脂性染料，无聚集趋势，避免了因染料聚集带来的假阳性；

2）不弥散，仅标记外泌体膜轮廓，不标记细胞膜，避免了染料弥散二次着色细胞膜带来的假阳性。Fig.2为弥散性亲脂染料DIO标记的外泌体与非弥散性EvLINK 505标记的外泌体被U251细胞摄取结果对比，可以看到明显的DIO弥散标记细胞膜的痕迹。

Fig.2 弥散性亲脂染料DIO标记的外泌体（a）与非弥散性EvLINK 505标记的外泌体（b）被U251细胞摄取

保留外泌体结构

EvLINK 被广泛应用于各种动植物细胞来源的外泌体的体内外示踪剂，对外泌体的形态学及其生物学功能的影响微乎其微。我们对EvLINK 标记后的外泌体进行TEM、nanoFCM和Western blot表征（Fig.3），发现：

1）标记后的外泌体在透射电镜下仍然保持标志性的外泌体茶托状结构；

2）标记后外泌体平均粒径分布差异不明显，仅增加~5 nm，这是大量EvLINK 均匀的负载在外泌体表面的结果；

3）Western blot 显示标记前后蛋白的条带位置不变，说明 EvLINK 不会标记外泌体表面蛋白。

Fig.3 被EvLINK （a）标记后和（b）标记前的外泌体的TEM图像；被EvLINK （c）标记后和（d）标记前外泌体的粒径分析（nanoFCM）;（e）EvLINK标记前后的外泌体Western blot：左为标记前的外泌体，右为经EvLINK标记后的外泌体。

EvLINK+CellLINK双染策略

基于FilmCLICK Tech.技术开发的CellLINK系列染料具有同样的膜标记特点，可以清晰的展现细胞膜轮廓，与EvLINK结合可以完美实现外泌体被细胞摄取实验。Fig.4 为EvLINK 505 标记的外泌体+CellLINK 标记细胞膜和PKH-67 标记的外泌体+F-actin摄取实验对比，图Fig.4a中可以看到CellLINK 555标记的清晰的红色膜轮廓，经过EvLINK 505标记后的绿色外泌体分散在细胞膜内；Yu等^[1]使用F-actin 标记细胞膜轮廓，PKH-67标记外泌体，尽管共聚焦显微镜下观测到的外泌体明亮的绿色荧光，然而该绿色荧光呈弥散状分布，难以较好区分外泌体与细胞膜。

Fig.4 （a）EvLINK 505 标记的外泌体+CellLINK 标记细胞膜和（b）PKH-67 标记的外泌体+F-actin标记细胞膜^[1]摄取实验对比

细心的同学可能注意到了，为什么merge中有黄色光点呢？这要从实验操作中探寻黄色光点的身份。有了EvLINK+CellLINK 染料组合，只需两步即可完成外泌体摄取实验：1）首先用EvLINK标记外泌体，去除游离染料后，与细胞共培养，此时细胞吞噬EvLINK标记的外泌体；2）使用CellLINK 标记细胞膜，PBS洗去游离染料后，共聚焦显微镜下观测即可。

Fig.5中，红色表示细胞膜，绿色表示外泌体，黄色颗粒状表示被EvLINK+CellLINK双染的区域，也就是未完全进入细胞膜的外泌体。

Fig.5 （a）CellLINK 555 （U251细胞膜）+EvLINK 505（牛奶外泌体）双染外泌体摄取实验（b）CellLINK 555（A549细胞膜）+EvLINK 505（牛奶外泌体）双染外泌体摄取实验

由于CellLINK 无细胞膜选择性（会标记外泌体）且完全不透过细胞膜，EvLINK+CellLINK双染策略不仅仅可以看到被细胞摄取的外泌体（绿色），还能清晰分辨出没有完全进入细胞膜的外泌体（黄色）。

基于FilmCLICK Tech.开发的EvLINK和CellLINK由于上述特性，我们推出了EvLINK+CellLINK双染技术，可以帮助科学家完美解决外泌体摄取实验中的假阳性问题。