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shRNA与microRNA定制产品

shRNA与microRNA定制产品
  • 价  格: ¥4000
  • 试用规格: 20微升
在线询问 已有 14 人申请试用
纽恩(上海)生物科技有限公司
商家诚信度:
成立时间:2013
入驻丁香通年限:9年
商家等级:普通客户
产品信息完整度:48.0%
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* 试用品 shRNA与microRNA定制产品 (14 人申请)
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试用说明

试用申请时间: 2014年02月21日— 2014年03月22日 由于病毒产品需要低温冷藏,因此我们需要1~2个工作日进行发货准备。

产品详情

规格: 产品价格: ¥4000

microRNAshRNA技术原理

RNAi技术起源于20世纪九十年代转录共抑制现象的发现。随后十年间,研究证明在高等生物体内,双链RNA可以按照碱基配对原则介导RISC复合物对mRNA进行切割,造成基因表达水平的下调即转录后基因沉默(图1)。Tuschl实验室根据对RNA片段的长度,序列组成以及mRNA的二级结构等因素对RNA干扰反应动力学的影响进行分析,总结得到了靶点序列设计原则——Tuschl 规则(图2)。并由此衍生了一系列的RNAi靶点筛选工具,如Sfold; siDirect; Dharmacon; Ambion; Qiagen等。鉴于siRNA序列是工具预测的结果,所以一般都需要进行有效性验证。

1 microRNAshRNA的作用机制

shRNA是利用真核生物III 型启动子表达框进行siRNA表达的DNA序列形式。III型启动子一般进行内源microRNA的表达,主要进行小片段RNA的表达。shRNA序列一般是由siRNA序列的正反义编码序列(茎结构),连接正反义序列的环结构,3’的修饰碱基以及两端的酶切位点组成。shRNA可以构建在质粒中,进行细胞转染操作,相比化学合成siRNA,更为稳定,作用时间也可以延长至1周左右1


2 Tuschl 规则

 

纽恩生物定制shRNA产品构建和包装服务

        纽恩生物提供的定制shRNA载体产品是根据客户所研究的目的基因,提供流程优化的靶点设计并构建在慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或腺病毒载体中。对于每个目的基因,纽恩一般提供3~4个shRNA序列进行构建,并保证其中至少有一个shRNA干扰效率达到70%以上2
        对于易转染的细胞,研究者可以使用该产品直接进行基因干扰效率筛选实验或进行功能表型研究。对于难转染的细胞或体内注射应用,研究者可以在易转染细胞中筛选获得有效靶点后进行病毒包装,采用病毒颗粒感染进行RNAi实验。  若需直接在难转染的目的细胞上进行干扰效率筛选,推荐您选购定制vshRNA颗粒产品。
提示:关于病毒种类和载体结构的选择,我们推荐研究者根据实验目的细胞的种类和实验方式具体进行选择(表1及表2)。

1 不同病毒的生物学特性比较

  慢病毒 逆转录病毒 腺相关病毒 腺病毒
包膜
颗粒直径 90-100 nm 90-100 nm 20-30 nm 60-90nm
基因组 dsRNA dsRNA ssDNA dsDNA
表达起始时间 48-72h 48-72h 72-96h 24-48h
表达持续时间 > 2 months  > 2 months  > 6 months  < 1 month
整合方式 随机高频整合 随机高频整合 定向低频整合 非整合
 

纽恩生物定制microRNA表达及抑制产品和构建服务

       纽恩生物在microRNA的表载体构建方面,主要提供II型启动子表达结构,并采用mmu-mir-155的框架。由于III型启动子框架不同microRNA表达效率差异的问题往往很突出。II型启动子载体,MicroRNA的发夹序列融合在EGFP报告基因的后面,模拟microRNA在体内的成熟过程,使得表达效率比III型启动子的构建方式更高。另外,这种结构还可以满足2或3个microRNA同时表达的实验设计要求4
        MicroRNA抑制可以通过两种方式进行(图3),一种是采用III型启动子表达microRNA成熟序列的反义互补序列(单链),即封闭序列。另一种为方式为microRNA吸收海绵——Misponge,这种方案是在标记基因GFP的后面重复串联多个与miRNA互补的序列达到竞争性结合miRNA成熟体的目的。CMV启动子的强启动活性并加上多个竞争性靶点可以有效的抑制体内miRNA的功能。这种方式更接近于miRNA自然结合方式,从而能达到更好的竞争性结合的目的。而且携带的GFP基因当其mRNA受到miRNA结合时,就会出现表达减弱,荧光变暗,从而直观的看到miRNA被结合的情况。


 图3 两种microRNA抑制载体结构

2纽恩生物常用shRNA载体列表

载体名称 载体类型 载体编号
pLKD-CMV-PuroR-U6-shRNA 慢病毒干扰载体 LKD001
pLKD-CMV-RFP-U6-shRNA 慢病毒干扰载体 LKD002
pLKD-CMV-GFP-U6-shRNA 慢病毒干扰载体 LKD004
pLKD-CMV-NeoR-U6-shRNA 慢病毒干扰载体 LKD006
pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA 慢病毒干扰载体 LKD007
pLKD-UbiC-GFP-U6-shRNA 慢病毒干扰载体 LKD008
pAKD-CBG-eGFP-H1-shRNA 腺相关病毒干扰载体 AKD001
pAKD-EF1A-eGFP-H1-shRNA 腺相关病毒干扰载体 AKD002
pRKD-FE1A-eGFP-U6-shRNA 逆转录病毒干扰载体 RKD001
pDKD-CMV-U6-shRNA 腺病毒干扰载体 DKD001
 

纽恩生物microRNAshRNA定制产品应用案例

 
1. 质粒转染细胞后的表达持续时间取决于细胞种类和培养条件。
2. 干扰效率是指采用qPCR检测mRNA的表达减少水平。
3. 参考文献:Dickins R A, Hemann M T, Zilfou J T, et al. Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors[J]. Nature genetics, 2005, 37(11): 1289-1295.
4. 多个microRNA串联表达时,其切割和表达效率并不能保证完全一致。
 
 
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