蛋白质不表达常见原因有:1.载体构建错误;2.宿主菌选择不当;3.密码子的使用频率低;4.质粒不稳定或者质粒丢失;5.蛋白酶将蛋白降解了;6.二级翻译起始位点;7.SD序列;8.mRNA的二级结构;9.意外终止;10.转录终止子;11.mRNA的不稳定性;12.检测方法的可行性。
发表于2009-08-17 04:41
蛋白质不表达常见原因有:1.载体构建错误;2.宿主菌选择不当;3.密码子的使用频率低;4.质粒不稳定或者质粒丢失;5.蛋白酶将蛋白降解了;6.二级翻译起始位点;7.SD序列;8.mRNA的二级结构;9.意外终止;10.转录终止子;11.mRNA的不稳定性;12.检测方法的可行性。
发表于2009-08-17 04:41
SDS-PAGE回收蛋白的方法: 1.先要大量上样,配好分离和浓缩胶后不要插梳子,其他电泳条件同。 2.跑完胶后,将胶放入缓冲液中冲洗,KCl染色液染色后,可以看到一条明显的白色条带,就是你的目的蛋白(无目的蛋白的空白呈透明状),切下谜底带,将其用碾磨棒碾碎,在其中适当(尽量少加,不要超过500 ul/块胶)加入PBS或其他缓冲液,在四度放置过夜或更长时间。 3.蛋白浸出后5000-10000 rpm 离心10 min ,取上清测蛋白浓度,如浓度过高可再稀释,这样也可以直接去免疫。 本方法只适用于10 kd 以上蛋白的切胶回收,太小或表达量底目的蛋白条带无法辨认。经过时间经验证实该方法可行! kcl染色液配方:1 mM DTT+ 0.25 M KCL+0.01 M 乙酸钠,溶于100 ml 水。
发表于2007-01-14 19:57
PCRfan: 对于该蛋白的特性都不知道,而要分离纯化,该怎么做?
跑SDS-PAGE,然后把相应条带切下来,送去做MOLDI-TOF Mass Spectrometry,可以确定你的目的蛋白是什么已知蛋白,如果是未知的,也可以根据Mass spect的片段详细分析结果得出肽链序列,然后翻译成DNA序列做PCR引物, PCR克隆。
发表于2004-02-04 16:30
聚乙二醇修饰反应类型: 在20种构成蛋白质的常见氨基酸中,只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰。常用的反应氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸,N-端氨基和C-端羧基。这些氨基酸残基上的反应性基团多呈亲核性,其亲核活性通常按下列顺序依次递减:巯基>alpha氨基>E氨基>羧基(羧酸盐)>羟基。
发表于2007-03-27 08:52
简述成人胰腺消化、胰岛分离方法: 尸体胰腺原位灌洗后置UW液中,4℃保存运输。到实验室后在4℃ Euro-Collins液中清除非胰组织,从胰管内插入穿刺针,丝线缝扎后用注射器灌注Liberase酶溶液(1.5 mg/ml)。胰腺充分膨胀后将胰腺切片,置消化罐中并放入数颗玻璃珠,加500μm孔径的不锈钢丝网,旋紧罐盖。开启蠕动泵将剩余的Liberase酶溶液泵入罐内,控制罐内温度37℃,手动振摇消化罐循环消化,于10分钟后开始取样镜检,待大部分胰岛分离后用冷的含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养液降温稀释终止消化。收集消化物用10% FBS 1640离心洗涤,将消化物混悬于150 ml UW液中,4℃冰浴30分钟。
发表于2005-10-11 14:34
既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性,这样溶解就会好得多,此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性,同时保护你的蛋白,你再做纯化就可以了,我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG 5000,这样的情况下蛋白还是活性回收率很高,我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好,你失去活性你可以监测一下提取,纯化,酶切到底哪里失去了活性,这样更容易解决你的问题。
发表于2004-05-21 16:34