实验心得 - 聚合酶链式反应(PCR)

  • zmj0630: 减少pcr产物中引物二聚体的方法

    减少引物二聚体的方法 1. 从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法; 2. 可能模板有问题; 3. 模板浓度过小,适当加大模板量; 4. Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高; 5. 取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的; 6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增强特异性; 7. PCR反应体系的配制在冰上进行,最后加TAq酶,PCR结束后,产物勿放置在室温下过长时间,有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体; 8. 增加循环数; 9. 降低退火温度后有条带,则应逐渐提高温度,若提高温度的同时产物量减少,则考虑增加镁离子浓度; 10. 若降低退火温度,发现还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在 20-25 mmol/l没有区别,则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀,导致吸取的试剂浓度不对。 11. 以上次的pcr产物作模板二次pcr,可以提高引物与模板的特异性,减少引物二聚体,如果两次时间间隔短的话,可以把原产物稀释100-1000倍,如果间隔较长可以稀释50-100倍;

    发表于2005-07-16 21:05

  • wufujun_01: 扩增不出来,结果很差,拖带很严重

    我也出现过相同的问题,给楼主几点介意,希望对你有用: 1.对反应体系中的因素的量进行调整。 2.减少引物的量,与引物二聚体有关。 3.对反应程序中退火温度,延伸时间适当做一下调整。 4.模板中的盐分污染也可能是影响的一大因素。 5.模板的多少与拖带有很大的关系。

    发表于2008-09-08 16:00

  • aaa: PCR的成败

    四条标准来判断PCR阳性: 1.条带宽不超过1mm,边缘整齐; 2.条带在期望的碱基大小之内; 3.背景上无smears,也无引物二聚体的出现则是PCR扩增失败,而非阴性反应; 4.如果出现期望的碱基大小之外的其它条带,不管是否有期望大小的条带,均应作为人工假像看待。

    发表于2003-02-16 15:34

  • 传说中的小明: 为什么以水为模板,总是有扩增曲线

    可能性很多,首先得考虑你自己的操作到底有没有失误。其次再从环境和试剂上找原因: 一、你有定期对实验环境照紫外消毒吗 二、你的实验器材是否有灭过菌?

    发表于2012-09-05 00:12

  • whr75: RACE PCR 资料

    invitrogen公司5’RACE的方法为寡核苷酸帽法(Oligo caping method),该方法特点为大规模、高通量、高精确度。

    发表于2004-06-29 17:39

  • sinviolet: 质粒载体能否做PCR进行扩增?

    首先,要看你的载体是环状的(如ET32a)还是线性的(如pMD-T).要是环状的就找合适的宿主转化再提出来就可以持续用了。要是线性的就不能这样做了。PCR的话首先要合成引物,还不能保证高保真性好,要确认的话还要测序,所以总的下来从时间和经济上考虑是不划算的。

    发表于2007-04-28 20:42

  • viviank: 如何提高PCR特异性

    一天P几百管的人可能不用担心条带有没有,而对于刚入门分子生物学的人来说,PCR能看到条带,能看到一条明亮的带就是入门最大的欣慰。师姐会告诉你,引物设计很重要,不能有二聚体和发夹结构;师兄也会和你说退火温度很重要。提高PCR特异性可谓是仁者见仁,智者见智。搜集了丁香园里网友们的讨论,精华汇总如下。

    发表于2006-07-13 10:50

  • wsgcc: 空质粒ppiczA电转GS115后PCR筛选遇难题

    我想有300多bp的片段出现,说明酵母细胞已经破碎(用的溶细胞酶),奇怪的是2.2KB的条带去哪里了?是PCR假阴性呢,还是菌落都是假阴性呢?唉!本来准备筛选出来好好过五一,看来计划赶不上变化了。各位老师,请帮帮我吧!不胜感激!

    发表于2005-11-17