不留下一片云彩
发表于 2012-01-03 13:53
这里只说说实验各组的作用
1.input:样本经过超声,但是没有进行ChIP,包含样本超声后总DNA,可以进行电泳,检测超声
效果,同时,可以与最后ChIP样本进行比较,看ChIP的效率(如果用同一引物进行PCR,ChIP组和
input组亮度差不多,说明ChIP效率高,基本上,样本中所有的目的基因片段都被ChIP下来了,反之
,说明效率低,实验条件有待改进)
2、阳性对照:一般用anti-RNA Polymerase II抗体,因为RNA Polymerase II是通用转录因子,
在所有细胞中都能结合基因(当然是在该细胞中表达的基因,所以为了保证阳性对照有效,一般选择
阳性对照的引物是根据管家基因设计的)的核心启动子区,因此,理论上ChIP后PCR都会有条带
3、阴性对照:用普通的IgG做为抗体,理论上不会ChIP下来任何DNA片段,因此作为阳性对照,
但是由于非特异结合,或者实验过程中,没发生结合的DNA清除不完全,可能也会出现条带,个人认
为这组最理想的结果当然是没有条带,但是如果有一条淡淡的条带(与阳性对照和目的基因组相比)
,也是不妨碍的。
4、实验组,这个就不多说了就是用自己感兴趣的转录因子去检测感兴趣的基因
四、引物设计
1、ChIP检测的是转录因子与基因启动子区的结合情况,因此引物设计要选择目的基因启动子区
,ChIP试验中启动子区一般选在转录起始位点上游1000bp的DNA片段(或者为了保险些选在2000bp)
,因为一般情况下,转录因子结合在这个区域,当然也有结合在更上游,或者有的文献报道在转录起
始位点下游也有结合,我们就不能一一考虑这些有点特殊的情况了,我实验的时候选择的是转录起始
位点上游2000bp的片段
2、引物设计原则跟普通的引物相同,但是,超声后DNA被打断,所以PCR产物要尽量短一些,100
多bp就足够了,因为产物长度越长,这段DNA被打断的可能性就越大,P出来的可能性就越小
五、固定与超声
个人认为虽然固定和超声只是样本的准备,但这步是实验成功的关键,也是出来漂亮结果的关键
。不同的仪器,超声的条件差别很大,所以不能单纯的按照说明书来做,要根据自己的仪器,摸索适
当的条件,另外,个人感觉超声时样本的体积不宜过大,体积过大超声容易不均匀,效果不理想,
400ul左右就完全可以(这个跟超声仪探头的直径也有关系)
六、ChIP
这是实验的主体部分,说明书对这些步骤说的已经够详细了,为了得到理想的结果,抗体孵育时
间和抗体的用量,可以适当调节,减少非特异,并最大程度的ChIP出目的基因。
作为一个新手,难免对实验的原理和操作过程有理解错误,也请各位战友批评。另外,记得以前
这个实验都是在免疫那个板块的,不知道发在这里合不合适,反正这里人气高