如何提高PCR特异性

viviank

发表于 2006-07-13 10:50

一天P几百管的人可能不用担心条带有没有,而对于刚入门分子生物学的人来说,PCR能看到条带,能看到特异性好的一条明亮的带就是入门最大的欣慰。师姐会告诉你,引物设计很重要,不能有二聚体和发夹结构;师兄也会和你说退火温度很重要。提高PCR特异性可谓是仁者见仁,智者见智。以下搜集了丁香园里网友们的讨论,精华汇总如下:
 
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提高PCR特异性的策略
1. 巢式PCR(Nest-PCR):增加有限量靶序列(如稀有mRNA)的灵敏度,降低了扩增多个靶位点的可能性,提高困难PCR(如5‘ RACE)特异性 。
2.递减PCR(TouchDown PCR):前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性,循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始,然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃,特异性最高的目的模板会被优先扩增,这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势,递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用,如AFLP、DNA指纹分析等 。
3.热启动PCR(HotStart PCR): 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到PCR 仪达到变性温度,通常选择热启动Taq酶,热启动PCR是除了好的引物设计之外,提高PCR特异性最重要的方法之一 。
4.使用PCR增强剂:甲酰胺,DMSO,甘油,甜菜碱等,可能的机理:降低熔解温度,有助于引物退火,辅助DNA聚合酶延伸通过,二级结构区,增强剂浓度要适当。
 
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1, 降低模板浓度
2、热启动PCR
3、touchdown PCR
4、设计Tm值超过72C的引物
强烈建议第3种
 
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如果模板是cDNA或基因组之类的建议预变性时间长点,可以用95℃10min。另外,Tm不能太低。一般变性温度95℃相比较94℃而言利大于弊,退火时间太长会导致非特异扩增。合成速度1Kb/s,所以40S足够了,延伸时间过长也会容易导致非特异性。另外不知道你是只为了扩出目标条带还是打算要做定量PCR?前者的话将产物割胶后做巢式PCR一定可以解决。如果定量的话建议重新设计引物,因为按我的经验,即使你按照我上面的程序优化,虽然可能会有改善,但实质性改善的可能性不大。另外,一般cycle数不要超过35,因为如果此时还扩不出产物,引物二聚体一般都出现,再扩下去也只是主要扩增引物二聚体。

网友评论

策略之一 巢式PCR(Nest-PCR):
1.增加有限量靶序列(如稀有mRNA)的灵敏度
2.降低了扩增多个靶位点的可能性
3.提高困难PCR(如5‘ RACE)特异性

发表于 2017-12-19

策略之二 递减PCR(TouchDown PCR)
1.前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。
2.循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始,然后每个循环降低1-
2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。
3.特异性最高的目的模板会被优先扩增,这些产物在随后的循环中继续扩增
占据优势。
4. 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用,如
AFLP、DNA指纹分析等

发表于 2017-12-19

策略之三 热启动PCR
1.热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到PCR 仪达到变性温度
2.通常选择热启动Taq酶
3.热启动PCR是除了好的引物设计之外,提高PCR特异性最重要的方法之一

发表于 2017-12-19

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