NEB
发表于 2011-08-23 08:46
根据您的描述,和您进行一些探讨:
1. 您酶切之后跑胶回收时,大小是正确的吗?SfiI限制性内切酶切割需要两个拷贝数的识别位点,单个的拷贝数是不能切割的,如果您酶切完全的话,这两个酶切位点之间有一段距离的话,应该是跑胶能分开的。
2. 您所说的大小的问题,如果不是载体自连,那么您提取的质粒应该是什么呢?是两个载体连在一起了吗?能不能根据载体的序列设计实验,用内切酶切割根据片段大小判断一下,究竟是什么呢?
3. 您成功构建的时候,实验设计和操作方面与其它有不同吗?
4. 用NEB的T4 DNA连接酶连接时,建议在10ul的反应体系中,插入片段和载体的量控制在1-10 ng/ul,摩尔比可根据自己的实验设计调整,室温连接(20-25度)2-4小时或者16度连接过夜;可以加入终浓度为15%的PEG6000增强连接效率。