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发表于 2012-05-16 23:04
1、引物设计有问题,可能你自己没分析过二级结构,不过能P出目的片段而且没有明显的杂带和二聚体,引物不需要重新设计了。退火温度需要调整一下,M1用57度,M2用51度,引物的量可以再增加一倍,以提高能与模板有效结合的引物的量。
2、模板量:明显太多了,电泳图中的涂抹带就是模板在高温条件下断裂的产物,20ul体系加0.5ul左右就够了,为了加样准确模板可以稀释一下。
3、DNA提取的质量:电泳图上看还是不错的,OD比值说明有RNA或者盐残留;电泳图中没看到RNA,也可能是因为残留的RNA已经彻底降解;另外如果有260/230比值,就能很直观的说明提取的质量的,这个比值理想值是2.5,高于2.0大部分实验都没问题。
另外,OD数据的1-6与DNA电泳图、PCR电泳中顺序是否一致,从左到右还是从右到左?但无论是哪个顺序都是无法对应的。
4、起始样品是什么。有一种情况,如果是肝素抗凝的血液,大多数提取方法都会有肝素残留,肝素会抑制PCR。
5、电泳上样量,只要能看清目的带就可以。