1.取20ml血清,加生理盐水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成20%(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30min。
2.3000r/min离心20min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白。
3.在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30ml,使成50%(NH4)2SO4溶液,充分混合,静置30min。
4.3000r/min离心20min,弃上清。
5.于沉淀中加20ml生理盐水,使之溶解,再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,静置30min。
6.3000r/min离心20min,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤5,2——3次。
7.10ml生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。
8.除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于4℃透析24h,中间换液数次。
以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4 (取3——4ml透析液,加试剂1——2滴,出现砖红色即认为有NH4 存在),直至无SO42-或NH4 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。
9.离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提IgG (即γ球蛋白,如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。
10.过DEAE——纤维素层析柱。(装柱过程见层析技术)。以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.03Mol/L NaCl)洗脱,收集洗脱液。
也可采用SephadexG150或G200柱。
11.蛋白质及其定量鉴定。
12.IgG的纯度鉴定,可采用下列方法之一鉴定。
①玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可
加样电泳后,只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时,同时可用全血清样品,不同浓度(NH4)2SO4盐析样品进行电泳,以资比较。
②琼脂双相双扩散鉴定
预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散,如IgG提纯的话,则在两样品孔之间出现一条沉淀线。
③免疫电泳鉴定
孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗IgG血清,琼脂扩散24h,观察结果。如果提取的IgG纯的话,则只出现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳,以资比较。
④圆盘电泳鉴定
用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带,而纯化的IgG则只有一条区带。
13.IgG的浓缩与保存
①IgG的浓缩
②IgG的保存
一般浓缩至1%以上的浓度,再分装成小瓶冻干保存,或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存,注意防止反复冻融。 |