质粒的转化及转化子的鉴定实验

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首页实验方法质粒的转化及转化子的鉴定实验

标签：质粒转化转化子鉴定

质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作（1）用于基因的克隆增殖；（2）筛选目的细胞。

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难度系数

4
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热激法
电转化法

实验方法原理	热激法：大肠杆菌在0 ℃ CaCl₂低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
实验材料	外源片段与载体的连接产物大肠杆菌感受态细胞
试剂、试剂盒	X-gal Amp LA培养基水抗生素
仪器、耗材	培养皿灭菌锅离心管摇床
实验步骤	1. l ml X-gal (20 mg/ml)，25 ml Amp（100 mg/ml），250 ml制备选择性培养基平板：在融化的250 ml LA培养基中250 mI PTG (200 mg/ml)，混匀后倒入灭菌培养皿中； 2. 取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 3. 每100 ul感受态细胞加入约20 ng质粒DNA，3管分别加连接产物、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟； 4. 热击：将离心管放置42 ℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管； 5. 冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟； 6. SOC培养基，在37 ℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；复苏：每管加400 ul 7. 布皿：取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板； 8. 培养：倒置培养皿，于37 ℃培养12－16小时即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子）
注意事项	1、利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不得超过105个菌落），同时37℃培养不应超过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。 2、鉴定转化子中是否含有外源DNA片段常用的方法有： 1) 互补； 2) 杂交筛选； 3) 插入失活（一些老质粒如pBR322等）; 4) 小量提取质粒酶切检测、PCR检测
其他	转化后，可以根据质粒上带有的某种特殊基因的表达来鉴定菌落，最常用的有：抗药性基因的表达，比如质粒带有氨苄抗性基因，能在AMP平板上长的一般可以初步判断为转化成功的菌；还有就是显色筛选，比如质粒上的LacZ基因表达，间接促使添加了X-gal的培养基变蓝，绿色荧光蛋白基因表达后菌落发荧光等。

实验方法原理	电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
实验材料	外源片段与载体的连接产物大肠杆菌感受态细胞
试剂、试剂盒	X-gal Amp LA培养基水抗生素
仪器、耗材	培养皿灭菌锅离心管摇床
实验步骤	1. l ml X-gal (20 mg/ml)，25 ml Amp（100 mg/ml），250 ml 制备选择性培养基平板：在融化的250 ml LA培养基中250 mI PTG (200mg/ml)，混匀后倒入灭菌培养皿中； 2. 取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 3. 连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上；每管感受态细胞加入1 μl 4. 电转化仪选择1800 V作为输出电压； 5. 将要转化的混合物加入预冷的1 mm的电转化杯中，立即按下按纽电击； 6. 立即加1 ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞； 7. 将细胞转入合适的培养管中37 ℃培养1小时； 8. 吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板； 9. 37 ℃培养过夜，观察结果。