标签: DNA质粒载体克隆
NA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。主要用于(1)外源性基因转染;(2)对外源性基因的转化分离。
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限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段,经DNA的纯化处理后用于连接反应;选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割,并用碱性磷酸酶处理防止载体自连;在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上,实现外源片段的克隆。
载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切:50 μl反应体系,用1.5ml tube,冰上操作)DNA 30 ulR.E 1 ul10xbuffer 5 ul
ddH2O 14 ul
外源片段酶切产物和5 ul 37 ℃反应1hr,分别取8 ul PUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全;按2-5步纯化、回收DNA2. 加入ddH2O 150 (扩大体积),加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),颠倒混匀,12000 g离心10 min;3. 吸取上清,加1/10体积3 M NaAc和两倍体积无水乙醇,-20 ℃放置15分钟以上;4. 12000 g 4 ℃冷冻离心15分钟;5. ddH2O(1.5 ml ddH2O(0.5 ml tube中),PUC18溶于20 ul 倒去上清,用75%乙醇浸洗沉淀,风干后外源DNA溶于10 tube中);6. 按以下反应去除载体PUC18的5'磷酸基团,50 ℃反应30 min 以上DNA 20 ul
CIAP(TaKaRa) 0.5 ul
buffer 4.0 ´10 μl
ddH2O 15.5 ul
7. 70 ℃水浴10 min, 使CIAP失活;8. 按2-5步纯化载体,溶于10 ul ddH2O;9. 连接反应DNA 10 ulpUC18 2.5 ulbuffer 1.5 ´ 5 ulmT4 ligase 3 U/ul16 ℃水浴过夜10. 转化大肠杆菌感受态细胞11. 转化子的鉴定
1. DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。
2. 氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用,它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏,操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂,能引起严重烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服,并在通风橱中进行。
1. 克隆中所用到的几种酶:(1)限制性内切酶(2)碱性磷酸酶(3)连接酶(体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶:大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶),但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都是首选的酶,因其能在正常的反应条件下能有效的将平端连接起来。
2. 载体的负载能力:即能克隆多大的DNA片段,是否有合适的限制性内切酶位点,酶切位点的性质,粘性或平末端,是否有选择重组克隆的其它标记,如蓝白斑筛选等。
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DNA2基因cDNA克隆质粒载体
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