常见问题原因分析
1. 跑出的DNA带模糊?
(1)DNA降解:避免核酸酶污染。
(2)电泳缓冲液不新鲜:电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。
(3)所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm,温度<30℃;巨大DNA链电泳,温度应<15℃;核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
(4)DNA上样量过多:减少凝胶中的DNA上样量。
(5)DNA样含盐过高:电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
(6)有蛋白污染:电泳前酚抽提去除蛋白。
(7)DNA变性:电泳前勿加热,用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
2. 有不规则DNA带迁移?
(1)对于λ/Hind III片段cos位点复性:电泳前于65℃加热DNA 5分钟,然后在冰上冷却5分钟。
(2)电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm,温度<30℃;经常更换电泳缓冲液。
(3)DNA变性:电泳前勿加热,用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
3. 跑出的DNA条带弱或无条带?
(1)DNA的上样量不够:增加DNA的上样量。
(2)DNA降解:避免DNA的核酸酶污染。
(3)DNA走出凝胶:正确连接电极方向避免插反的情况,缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度。
(4)所用光源不合适:对于用EB染色的DNA应用短波长(254nm)紫外光源。
4. 跑出的DNA带缺失不完整?
(1)如果是小DNA带,可能跑出凝胶,可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。
(2)分子大小相近的DNA带不易分辨,应延长电泳时间,并核准正确的凝胶浓度。
(3)DNA变性:电泳前勿加热,用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
实验方法出处来源《分子克隆实验指南 |