标签: 血红蛋白 筛查 步骤
本实验主要用于筛查异常血红蛋白。
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血红蛋白是一种结合蛋白质,由血红素和珠蛋白组成。正常人所含珠蛋白的多肽链有a、b、d 、e、g和z六种。这六种肽链的基因在人体发育的不同阶段表达状况不一。正常成人红细胞中有三种血红蛋白即HbA、 HbA2 和 HbF。HbA(a2b2)是正常成人红细胞中的最主要的血红蛋白,占红细胞内血红蛋白总量的96%以上,PI=6.7。 HbA2(a2d2) 是正常成人红细胞中的次要成分,占2~3% 左右,其PI>6.7。 HbF(a2g2)为胎儿血红蛋白,胎儿出生后六个月急剧持续下降至血红蛋白总量的1%以下,其PI接近 6.7。各种血红蛋白在pH8.5的缓冲液中均带负电荷在电场中都向阳极移动,但因等电点不同所带电荷数目不同而有不同的电泳速度。HbA因其所带电荷最多故向阳极泳动速度最快,又因其含量最多区带颜色最深。其后有一较浅的区带为HbA2,HbF与HbA的等电点接近,通常与HbA分不开。
异常血红蛋白是指由于基因突变而导致结构异常的红蛋白。异血红蛋白具有与正常血红蛋白不同的电泳行为,因此用电泳的方法可以将其检出。例如HbS是一种由b-链第6位的谷氨酸被缬氨酸所替换而形成的异常血红蛋白,此变异体比HbA少带两个负电荷,因此,向阳极移动的速度比HbA慢,出现于HbA与HbA2之间。
分析血红蛋白的电泳方法有许多,如滤纸电泳,淀粉胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。但异常血红蛋白筛查最常用的还是醋酸纤维薄膜电泳法。因为醋酸纤维薄膜做支持体电泳操作简便,电泳速度快,分辨力强区带集中而且对染料不吸附,容易定量。用醋酸纤维素薄膜电泳筛查异常血红蛋白的检出率为1~2‰。
1. 浸膜:将醋酸纤维素薄膜膜面向下放入浸膜液中,浸透后用眼科镊子压入液面底部。
2. 采血:碘伏消毒耳垂部,用一次性采血针采血,并将血液吸在两次对折的滤纸尖部。
3. 加样:将浸泡好的醋酸纤维素薄膜膜面向上放在滤纸上,用滤纸吸去多余的液体,在距一侧1.5cm处用沾血的滤纸涂圆点状(直径约0.2cm)或线状。
4. 电泳:将加好样的醋酸纤维素薄膜膜面向下放入电泳槽中的缓冲液纱布上,加样端放在负极,静置2分钟后开启电源,调电压200伏,电泳40分钟。
5. 电泳结束后,关掉电源,观察电泳图谱,并记录红色区带(几条)及分布(位置)情况。
6. 染色: 将醋酸纤维素薄膜放入染色液中2分钟,然后转入漂洗液中洗至背底呈白色,再观察结果。
1. 醋酸纤维素膜一定要浸透(无白色斑点),加样前从浸膜液中取出,既要吸去多余的液体还不能使膜太干,否则都会影响电泳结果。
2. 加样时注意要加在醋酸纤维素的膜面,电泳时也要膜面向下放到电泳槽中的缓冲液纱布上。
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