为什么做的western最后都没有显出影啊?

为什么做的western最后都没有显出影啊?

张振1986 13 评论 315 阅读

最近开始做western,结果非常不理想,第一次做的时候,内参和目的基因均显示出来,就是内参不齐,打算再做几次验证一下,可是接下来做了3次什么都没显出来啊,现在非常郁闷啊,想请各位老师帮忙指点一下。我具体是这样操作的,目的蛋白55KD,内参36KD,上样量20ul,总分子质量大约为25ug。10%浓缩胶,4%分离胶,电泳80V 30min,100V 120min,转膜90V 100min,5%脱脂奶粉封闭1h,TBST5minx3次,一抗4c孵育过夜,TBST5minx3次,二抗室温孵育1h,显影。电泳过程中条带我看的很好,转膜我也感觉没有问题,现在不知道是什么原因啊,十分着急,请求指教。谢谢

超方便的实验干货查询工具

微信扫码进入「丁香实验」小程序

13 条评论
  1/3  

  • wuhao88 2013-04-10  6

     在两个实验室遇到过ECL试剂盒出问题,第一次是前人用试剂盒时吸取液体没有换枪头,试剂盒污染;第二次是师兄用下来的试剂盒,开封日期已经2年,最后验证是试剂盒失效,换了试剂盒之后就曝出很漂亮的条带,浪费了我半个月时间。我遇到同样的问题是从头找起的:先用考马斯亮蓝染胶看看胶上有没有蛋白,排除蛋白被降解,如果没有问题,再用考马斯亮蓝染转膜后的膜,可以看到膜上是不是有蛋白,如果还没有问题,就要注意二抗是不是和一抗吻合的,二抗要用HRP标记的,这还没有问题的话,换个ECL试剂盒试试吧,如果涂ECL之后能看到条带的话说明前面都没有问题,最后的问题可能是胶片曝光了,显影液、定影液出问题了。

  • prime0711 2013-04-17  4

    如果你的实验条件都没变的话,有可能是蛋白反复冻融降解了,或者抗体失活。也有可能是显影定影剂放久了,一般有效期只有三个月,或者没有完全避光保持。至于你第一次做的内参不齐,考虑孵育抗体时没混匀,要让膜在密封袋里漂浮转动才行。

  • zerg2_1 2013-04-10  4

    10%浓缩胶,4%分离胶,电泳80V30min,100V 120min.4%的胶跑这么长时间,估计蛋白都跑没了吧。建议你1:转完膜用丽春红或者快绿染色看一下蛋白有没有转过去           2:跑完的胶蓝染,看有没有条带。

  • alaling 2013-04-09  3

    在做western的时候,有一步的“质控”非常重要,就是转膜后的丽春红染色。这一步能鉴定你的蛋白是否已经转在膜上了。如果丽春红染色有条带,说明是后续的抗体杂交或者曝光的问题,如果丽春红染色都没有条带,说明问题出现在转膜之前的步骤,如蛋白样本出现问题、跑胶出现问题、转膜出现问题等。另外,做实验要弄清楚每一步的原理,你说“电泳过程中条带我看的很好,转膜我也感觉没有问题”,应该都是没有道理,而只是你的直觉的,想要真正找到原因,要一步一步来排查的。另外如果一点都没显影的话,应该不是牛奶浓度的问题,也应该不是抗体浓度的问题,这些只会影响你的显影质量而不会影响你是否出条带。

  • wangyx520 2013-04-17  2

    我觉得分离胶的浓度可以降点 电泳时间没必要那么长啊

  • 请登录后参与评论,

    我的询价

    询价列表

    暂时没有已询价产品

    inquiry icon 快捷询价
      当你希望让更多商家联系你时,可以勾选后发送询价,平台会将你的询价消息推荐给更多商家。
      个人收货地址

      编辑个人收货信息

      yanxuan

      关注「丁香通研选」

      微信及时获得商家回复,

      获得更多交易信息和保障。

      丁香实验小程序

      微信关注
      丁香实验

      意见反馈