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小鼠睾丸、附睾及输精管精子采集、运动能力检测与结构观察实验

标签: 小鼠 睾丸 采集

本实验目的是:(1)掌握小鼠睾丸、附睾及输精管精子采集方法;(2)掌握血球计数板法精子计数和运动能力检测的方法;(3)通过睾丸、附睾及输精管精子运动能力检测,认识精子在睾丸产生后,在附睾内成熟的过程;(4)掌握精子抹片方法;(5)掌握染色法进行精子结构观察和顶体结构观察的方法,认识精子的正常结构。

实验方法
  • 血球计数法
实验方法原理

哺乳动物的精子形成后必须经过在附睾内发生一系列形态、生理和生化方面的变化而最终达到成熟后,才能获得向前运动的能力,这种向前运动是精子受精能力的重要指标。哺乳动物精子包括头部和尾部二个主要部分,颈部介于头部和尾部之间,形成头部和尾部的连接。精子头部主要由核组成,头部前端是顶体,顶体包围核的前端形成帽状。精子颈部变细并形成头部和尾部的连接。尾部是精子的运动器官,可以分为中段、主段和末段。 

实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、精子采集

左手捏小鼠尾部,右手持镊子,或以图4-1所示方法,以颈部脱臼法处死实验鼠。使处死的小鼠仰卧,用用75 %酒精棉球消毒腹部开口部位被毛及皮肤。剪开腹壁,暴露生殖系统。无菌采取分离睾丸、附睾及输精管。在含培养液的表玻皿中,用眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围的系膜及脂肪,并冲洗干净,以免血液或脂肪球混入液体妨碍精子观察。

将分离并清洗干净的睾丸、附睾及输精管,用眼科剪再分离为睾丸、附睾尾及附带的小段输精管、其余部分的输精管三部分,弃去附睾头。采集睾丸精子时,将睾丸横切为若干段或组织块,在表面皿中,加1 mL培养液,用眼科镊子轻轻挤压睾丸组织块,把精子挤入培养液中,去掉组织块。于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育20分钟,使精子自行散开。

采集附睾尾精子时,将其剪成几段,用眼科镊子轻轻挤压附睾和输精管,把精子挤入培养液中,去掉附睾和输精管。于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育20分钟,使精子自行散开。采集输精管精子时,由于小鼠输精管非常细,不能直接冲洗管腔,将输精管放入含有1mL 培养液的表面皿内,在实体显微镜下,用一支眼科用异物针固定输精管,用另一支异物针向相反方向纵向撕开输精管,精子会浮游到稀释液中。将大块输精管组织拨开,用吸管连同精子吸出液体部分,装于2 mL具塞试管中暂存。

二、精子运动能力检查

用滴管吸取精液,放于血球计数板的计数室与盖玻片接触处,使精液自然流入计数室中。计数中间5个中方格(对角5个或四角及中间)内80个小方格的精子数,计数值为X。计算时,先计数死精子的X1值,将计数板置于50 ℃水浴锅中的搪瓷盘中,在50 ℃条件下10 min杀死精子,计数总精子数X2值,(X2-X1)/X2为精子运动能力。计数时每份精子用三个计数板重复计数三次,取平均值。

三、精子整体结构观察

取1小滴保存精液在载玻片上,将样品滴以拉的形式制成抹片。用0.5 %龙胆紫酒精染色3min,自然干燥、水洗后镜检。镜下可观察到大多数为结构正常的精子,部分为畸形精子,如头部畸形(如头部巨大、瘦小、细长、圆形、轮廓不明显、皱缩、缺损、双头等),颈部畸形(颈部膨大、纤细、屈折、不全、双颈等),尾部中段畸形(膨大、纤细、弯曲、屈折、不全、双体等),尾部主段畸形(弯曲、屈折、回旋、短小、长大、双尾等)分类计数。有的精子尾部发育未完成,为未成熟精子,可视为畸形精子。

四、精子顶体结构观察

精液抹片自然干燥2~20 min,以1~2mL的福尔马林磷酸盐缓冲液固定15 min,水洗后自然干燥。用姬姆萨工作液染色90 min,水洗,风干。置于1000倍显微镜下用油镜观察、计数顶体异常精子。镜下可观察到大多数精子顶体结构正常,部分精子顶体异常,精子顶体异常主要表现为肿胀、缺损、部分或完全脱落。
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注意事项
在含培养液的表玻皿中,用眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围的系膜及脂肪,并冲洗干净,以免血液或脂肪球混入液体妨碍精子观察。
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  • dxy_daacac

    dxy_daacac

    3个月前 觉得一般

    此说明当中X2与X1计算得来的比值应该是活精子的比例,但以此来作为精子活力的参照值未免有点太笼统了。

  • 我爱我家0038

    我爱我家0038

    3个月前 觉得很难

    还是不会

  • 天灬仇

    天灬仇

    3个月前 觉得一般

    (X2-X1)/X2是否可以理解为 1-死精子数/总精子数?这可以来评判精子运动能力吗?

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