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标签： 小鼠睾丸采集
本实验目的是：（1）掌握小鼠睾丸、附睾及输精管精子采集方法；（2）掌握血球计数板法精子计数和运动能力检测的方法；（3）通过睾丸、附睾及输精管精子运动能力检测，认识精子在睾丸产生后，在附睾内成熟的过程；（4）掌握精子抹片方法；（5）掌握染色法进行精子结构观察和顶体结构观察的方法，认识精子的正常结构。
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| 实验方法原理 |
哺乳动物的精子形成后必须经过在附睾内发生一系列形态、生理和生化方面的变化而最终达到成熟后，才能获得向前运动的能力，这种向前运动是精子受精能力的重要指标。哺乳动物精子包括头部和尾部二个主要部分，颈部介于头部和尾部之间，形成头部和尾部的连接。精子头部主要由核组成，头部前端是顶体，顶体包围核的前端形成帽状。精子颈部变细并形成头部和尾部的连接。尾部是精子的运动器官，可以分为中段、主段和末段。 |
|---|---|
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 |
一、精子采集 左手捏小鼠尾部，右手持镊子，或以图4-1所示方法，以颈部脱臼法处死实验鼠。使处死的小鼠仰卧，用用75 %酒精棉球消毒腹部开口部位被毛及皮肤。剪开腹壁，暴露生殖系统。无菌采取分离睾丸、附睾及输精管。在含培养液的表玻皿中，用眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围的系膜及脂肪，并冲洗干净，以免血液或脂肪球混入液体妨碍精子观察。 将分离并清洗干净的睾丸、附睾及输精管，用眼科剪再分离为睾丸、附睾尾及附带的小段输精管、其余部分的输精管三部分，弃去附睾头。采集睾丸精子时，将睾丸横切为若干段或组织块，在表面皿中，加1 mL培养液，用眼科镊子轻轻挤压睾丸组织块，把精子挤入培养液中，去掉组织块。于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育20分钟，使精子自行散开。 采集附睾尾精子时，将其剪成几段，用眼科镊子轻轻挤压附睾和输精管，把精子挤入培养液中，去掉附睾和输精管。于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育20分钟，使精子自行散开。采集输精管精子时，由于小鼠输精管非常细，不能直接冲洗管腔，将输精管放入含有1mL 培养液的表面皿内，在实体显微镜下，用一支眼科用异物针固定输精管，用另一支异物针向相反方向纵向撕开输精管，精子会浮游到稀释液中。将大块输精管组织拨开，用吸管连同精子吸出液体部分，装于2 mL具塞试管中暂存。 二、精子运动能力检查 用滴管吸取精液，放于血球计数板的计数室与盖玻片接触处，使精液自然流入计数室中。计数中间5个中方格(对角5个或四角及中间)内80个小方格的精子数，计数值为X。计算时，先计数死精子的X1值，将计数板置于50 ℃水浴锅中的搪瓷盘中，在50 ℃条件下10 min杀死精子，计数总精子数X2值，(X2-X1)/X2为精子运动能力。计数时每份精子用三个计数板重复计数三次，取平均值。 三、精子整体结构观察 取1小滴保存精液在载玻片上，将样品滴以拉的形式制成抹片。用0.5 %龙胆紫酒精染色3min,自然干燥、水洗后镜检。镜下可观察到大多数为结构正常的精子，部分为畸形精子，如头部畸形(如头部巨大、瘦小、细长、圆形、轮廓不明显、皱缩、缺损、双头等)，颈部畸形(颈部膨大、纤细、屈折、不全、双颈等)，尾部中段畸形(膨大、纤细、弯曲、屈折、不全、双体等)，尾部主段畸形(弯曲、屈折、回旋、短小、长大、双尾等)分类计数。有的精子尾部发育未完成，为未成熟精子，可视为畸形精子。 四、精子顶体结构观察 精液抹片自然干燥2～20 min，以1～2mL的福尔马林磷酸盐缓冲液固定15 min，水洗后自然干燥。用姬姆萨工作液染色90 min，水洗，风干。置于1000倍显微镜下用油镜观察、计数顶体异常精子。镜下可观察到大多数精子顶体结构正常，部分精子顶体异常，精子顶体异常主要表现为肿胀、缺损、部分或完全脱落。  |
| 注意事项 | 在含培养液的表玻皿中，用眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围的系膜及脂肪，并冲洗干净，以免血液或脂肪球混入液体妨碍精子观察。 |
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