标签: 甲基化 特异性 PCR
甲基化特异性PCR主要用于特意位点甲基化的检测。
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MSP是一种简便、特异的、敏感的检测单基因甲基化的方式。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因 组DNA,未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳,凝胶扫描观察分析结果。
1. 3M亚硫酸氢钠(pH5.0)和10mM对苯二酚需要临用前新鲜配制。
2. Bisulfate处理后的DNA样本易降解,应尽快使用,尽量减少反复冻融,使用时样品保持在冰上,使用后剩余样品尽快放回至-20℃冻存;若较长期保存应放置在-80℃。
3. 每次PCR反应都应设置甲基化阳性对照(IVD)和非处理样品对照(非甲基化阳性对照)。
4. 不同基因和不同样本的MS—PCR反应参数往往不相同,尤其是退火温度和反应循环数等,有时需要通过反复的预实验确定最佳反应参数。
2.MSP的反应体系问题MSP的反应体系的成分与普通PCR一样,反应体系的优化也与普通类似,反应体系的优化与普通PCR的反应体系中最大的区别是DNA模板不同。经过修饰后的模板为单链状态,MSP的DNA模板在抽提后应检测其纯度和含量,其纯度要求A260/A280在1.8——2.0之间;其含量要准确检测,否则在亚硫酸盐处理时因DNA模板加的太多而导致DNA处理不完全而导致MSP扩增失败;而加的DNA模板太少则一方面浪费试剂,另一方面会因为目的片段太少导致MSP假阴性。Mg“浓度一般在2.0——2.5 mmoL/L为宜,过低过高都不利于扩增。此外,PCR的缓冲液及Taq酶的来源也很重要,一般的PCR缓冲液常常会导致结果不稳定,不同来源的Taq酶也会影响结果的重复性。我们建议用Taka—ra公司针对富含CG等复杂二级结构模板的TaKaRa IATaq with GC Buffer效果较好。而一旦选用某一厂家Taq酶后,不要轻易更换,以免MSP因重新优化而引起的时间和成本的浪费。
3.MSP的反应温度分析MSP扩增的结果有3种情况:(1)产物电泳为阴性;(2)产物电泳出现多条非特异性条带(含目的基因条带);(3)产物电泳为阳性(仅目的基因条带)。出现前2种情况时,可在保证反应体系和引物没有问题的情况下,通过调整MSP的反应温度而得到目的基因带。方法如下:PCR反应中,Tm的高低与CG含量呈正相关。因甲基化与未甲基化引物序列差异,在扩增过程中可能会出现PCR偏性。我们建议,提高预变性温度(一般应>95℃,10 rain)和变性温度(>95℃ ,1 min),退火温度以60℃作梯度或70℃作降落PCR。
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