穿透里检测也没有蛋白条带吗?敢问你是用什么洗脱液洗脱的,一般都是用咪唑,0.5M的咪唑柱子上的所有的蛋白基本上都就洗下来了(如果咪唑实在洗不下来的话可以用EDTA洗)……至于你所说的纯化得到目的蛋白,这个咪唑的洗脱浓度还得靠你自己去摸索。你说的是蛋白洗不下来,建议你如果是用低于0.5M的咪唑洗的话,可以考虑0-0.5M的咪唑走个短点的线性梯度,可以大概看下目的蛋白洗脱的大致咪唑浓度。
建议重新装柱,使用新的填料尝试一下,一般300mM的咪唑基本可以把目的蛋白洗下来,前提是先用低浓度的咪唑洗去杂蛋白。还有就是最好在平衡柱子的时候在缓冲液里加入低浓度的咪唑,一般10mM即可,有利于蛋白挂柱。
重组蛋白纯化挂柱无法洗脱通常有以下几个原因:1. 如果N-和C-同时带有组氨酸标签,会使洗脱的咪唑浓度增加2.蛋白本身的PI过高也会增加洗脱难度3.洗脱缓冲液的pH过高4.纯化过程中蛋白变性沉淀
换咪唑,并确定缓冲液本身的成分和pH,可能你的某个试剂出现了问题
估计没挂住柱子