PTWIN1做表达载体表达蛋白的问题

PTWIN1做表达载体表达蛋白的问题

王希lily 3 评论 131 阅读

我的表达载体是pTwin1,目的片段和载体均用BamHI 和NruI双酶切,连接,转化入T克隆菌,菌液验证,测序,测序正确;从该菌中提取重组质粒,转化表达菌BL21,菌液验证,然后1:100接种摇菌至OD600为0.6左右,加入IPTG 0.5mM,37度诱导,分别1小时,2小时,3小时,4小时,过夜取样,跑SDS-PAGE,看是否有目的条带。 pTwin1带有两个标签,但我用酶已经切掉了一个,所以他自身只带有一个大约24KD的标签,加上我的目的片段一3KD,大小应该为27KD左右;目的片段二25KD,大小应该为49KD。 我想问 :我的目的蛋白测序正确但好像没表达,怎么回事呢?我已经做了2个月了,很急,请大家帮忙看看,谢谢了。  目的片段一:1为PTWIN1未诱导,2为PTWIN1诱导,3为目的片段未诱导,4-8分别是1h目的片段取诱导样,2h目的片段取诱导样,3h目的片段取诱导样,4h目的片段取诱导样,目的片段过夜诱导取样。MARKER是(最上面那根不算,由上到下116,66.2,45,35,25,18.4,14.14)该目的蛋白应在27KD处表达,但仔细看好像没有表达。  目的片段二:MARKER是(最上面那根不算,由上到下116,66.2,45,35,25,18.4,14.14)1为PTWIN1未诱导,2为PTWIN1诱导,3为目的片段未诱导,4-8分别是1h目的片段取诱导样,2h目的片段取诱导样,3h目的片段取诱导样,4h目的片段取诱导样,目的片段过夜诱导取样。该目的蛋白应在49KD处表达,但仔细看好像也没有表达。

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3 条评论
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  • 也可以用标签抗体做个WB,表达量低,WB可以检测出来

  • 王希lily 2014-11-20  0

    谢谢了,我之前也优化过时间和温度,但表达量太低了,感觉几乎没表达,所以有点着急。

  • viviank 2014-11-17  0

    测序正确,但没表达,这个现象很正常。几点建议:1、直接放弃,重新设计再从来来一遍,虽然残忍,但现实就是如此。2、将你测序过的质粒重新PCR,再验证下。你的OD、IPTG浓度、诱导温度都没有太大问题,可以建议做个梯度优化试试,比如温度,比如诱导时间,比如IPTG,建议参考文献,看看人家的条件,在那个范围做梯度。3、将你的蛋白浓缩试试,可能表达的量不够,导致上样量太少,跑胶没显示。祝你好运吧。

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