刚开始做PCR,因为不懂重要性,随便挑了个聚合酶,结果千辛万苦构建克隆表达载体成功后,挑选转化子送去测序,好多都突变了,请教了师兄师姐才明白,一定要选好的酶,保真性要好,但具体该怎么选呢?
传统的高保真酶例如pyrobest没有什么可说的,保真性一般是普通Taq酶的10倍以内。但传统的高保真酶最大的缺点是扩增能力差,长一点儿的基因很难有效扩增,要摸很多条件,一个字麻烦。最近可以买到的高保真酶选择的机会多一点儿了,有宝生的primer star,还有人提示的Taq plus(这个酶没有详细了解过),上述这两个酶的扩增能力我没有详细了解过,有兴趣的可以去打听一下。最高保真的酶可能要数NEB的phusion了,比普通的taq酶保真性高50倍,扩增能力又超强,1k/15s,扩增长度为10k的序列不在话下(最长的我做过10k),更长的也应该可以。这个酶最大的缺点是贵,100u的酶1000元。所幸的是现在有替代这个酶的候选了,全式金的fast pfu能力与phusion相当,价格是400-500元250u(或者更少,没有记清楚),这个酶在我做定点突变的时候用过,测序显示4.2k序列几乎可以保证没有错误。
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