最近师兄让我帮他做IFN-γ的PCR,用正常人cDNA和molt4、jurkat细胞株均尝试了55°,58°,60°,65°的退火温度,均不能扩出目的片段,只能见到引物二聚体,β2M能够扩出来,说明体系应该没有为题,引物有introvegene提供。请各位高手指点,排除引物的问题还可怎样进行尝试? IFN-γ的片段大小为553kb, 上游引物:5' GCTCTAGAGATTTCAACTTCTTTGGCTTA 3' 下游引物:5' TTGTCGACGCAGGCAGGACAACCATTACT 3'
如果引物设计的没问题的话,两个建议:1.降落PCR,2.先将引物对99℃10s,再放冰上,再加到PCR体系里,试一试
你的引物片段好长啊,而且你这个是人IFNG的引物么?我用PRIMER 5验证了一下,有些序列和人的IFNG匹配不上啊,你这个引物是自己设计的还是找公司设计的还是文献上给的啊,文献的话IF是多少啊?我把PRIMER 5的结果给你看一下,你这个还不能够拿到BLAST上去验证,因为和IFNG匹配不上,大概看了一下你这个引物还是存在一定问题的
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