1. NK功能效应细胞可取静止的PBMC,或经不同细胞因子诱导的PBMC。
2. LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或体液(癌性胸腺水)中分离的淋巴细胞(1×106/ml)在含有高剂量IL-2(200~1000 ul/ml)的10%FCS RPMI 1640诱导2~5 d 而成。
二、杀伤试验
主要有51Cr 4 h 释放法和3H-TdR释放法,前者操作时间短,非常敏感;后者需要无菌操作,所需时间较长。
1. 51Cr4h释放试验
(1)收获处于对数生长期的靶细胞(K562、LiBr等),洗涤后调整细胞浓度为2×106/ml
(2)取1×106细胞(0.5 ml),加Na251CrO4 100 uCi,37度孵育2~3 h,每15 min 轻轻振摇一次。
(3)用10%FCS RPMI 1640洗涤3次,每次800 rpm、5 min。
(4)重悬细胞浓度1×105/ml。
(5)96孔v型或U型培养板中,每孔加100 ul(1×104细胞),设3个复孔。
(6)每孔加入100 ul 不同细胞浓度的效应细胞,最大释放组加入100 ul 1%Triton X-100;自然释放组加100 ul 完全培养基。
(7)200g离心1 min。
(8)37度、CO2孵箱培养4 h。
(9)200 g 离心1 min。
(10)每孔取出100 ul 上清,β计数仪测定值。
(11)计算:特异性杀伤率(%)=(实验组cpm-自然释放cpm)/(对照组-自然释放cpm)
2. 3H-TdR释放试验
(1)收获处于对数生长期的靶细胞(K562、LiBr等),洗涤后调整细胞浓度为2×106/ml,加3H-TdR 20 uCi。
(2)7度孵育2~3 h。
(3)用10%FCS RPMI 1640洗涤3次,每次800 rpm、5 min,调整浓度为1×105/ml。
(4)96孔U型或平底培养板中,每孔加100 ul(1×104细胞),设3个复孔。
(5)每孔加入100 ul 不同细胞浓度的效应细胞,最大释放组加入100 ul 1%Triton X-100;自然释放组加100 ul 完全培养基。
(6)CO2孵箱培养18~24 h。
(7)每孔取出100 ul 上清,加入胰蛋白酶(终浓度0.15%)和DNA酶(终浓度为0.0125%)
(8)继续孵育30 min。
(9)用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上。
(10)烤干后,β计数仪测定值。
(11)计算:特异性杀伤率(%)=(1-实验组cpm/对照组cpm)×100%