实验材料 | |
---|---|
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1. 制备抗原样品,并用小型或标准尺寸的单向或双向凝胶分离蛋白,在一个或多个泳道中分离预染色或生物素酰化的蛋白质分子量标准。
2. 电泳完成后,拆卸凝胶夹层,去除积层胶。以适量的转移缓冲液室温平衡凝胶30 min。 3. 将转移盒放入一个较大的托盘中,加入足量的能盖没整个转移盒的转移缓冲液。
4. 在塑料转移盒的底边,依次将下面物品组装转印夹层垫或海绵,一张剪切得如凝胶大小的滤纸,并预先以转移缓冲液湿润凝胶,用一试管或玻璃棒在凝胶表面缓慢滚动,以排去凝胶和滤纸间的气泡。
图一、利用转印槽进行免疫印迹
5. 准备转印膜,按凝胶大小但各边都比凝胶大约1 mm 剪膜。成45。地慢慢将凝胶放入蒸馏水中,水将会渗进膜中并润湿整个表面。然后在转移缓冲液中平衡10~15 min,PVDF膜短暂地在100%甲醇中放一下,然后在转移缓冲液中平衡10~15 min。
6. 用转移缓冲液湿润凝胶表面,直接将已润湿的膜放在凝胶顶部,排去气泡。
7. 润湿另一张Whatman 3MM 滤纸,并置于膜的阳极面,排去所有气泡,在滤纸的顶部放另一块Scotch-Brite垫或海绵。
8. 将转移盒顶部的半面放置适当,扣紧,完成组装。
9. 往转移槽中加入转移缓冲液,按正确的极性方向将转移盒放进电转仪中,连接电源。
10. 在冷却条件下100 V 电转30~60 min,或在冷室中14 V 电转过夜, 11. 关电源,拆卸转印装置,取出转印膜,并在膜上剪一小角或用软性铅笔或Paper-Mate笔作上标记定位。
12. 凝胶用考马斯亮蓝染色以确定转移效率。需要时,也可将硝酸纤维素膜或PVDF膜以辅助方案提供的可逆染色方法使蛋白质显迹,也可用如考马斯亮蓝、印度墨墨汁、萘酚蓝或胶体金不可逆染色。
13. 进行蛋白质的免疫杂交和显迹。 |
实验材料 | |
---|---|
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1. 制备样品,并在小型或标准尺寸的单向或双向凝胶上分离蛋白质。
2. 准备转印膜
3. 拆卸凝胶夹层,除去积层胶。 4. 组装转印夹层:
Mylar聚酯薄膜屏蔽物
3张以转移缓冲液饱和的滤纸 已平衡的转印膜 凝胶
3张以转移缓冲液饱和的滤纸
当每一组分往上堆叠时,需排除气泡。
5. 在转移夹层的顶部放置顶电极。
6. 小心将高压导线和电源相连。在恒流下转移蛋白。通常只需转移1 h。
7. 转移后,关闭电源,拆卸转移装置,取出膜,标记好凝胶方向。进行染色和免疫检测。
图一、利用半干转移系统中进行免疫印迹 |
实验材料 | |
---|---|
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1. 将膜放入可热密封的塑料袋,加5 ml 封闭液,密封塑料袋,在旋转摇床或摆动平台中摇动30~60 min。
2. 用封闭液稀释第一抗体(取决于抗体和检测系统,以1:10~1:100 000稀释)。
3. 打开袋子,倾去封阻液,以稀释的第一抗体工倾代替之。在室温下持续摇动30~60 min。 4. 带着手套从塑料袋子中取出膜,放在塑料盒子中摇动着用200 ml TTBS(硝酸纤维素膜或PVDF膜)或TBS(尼龙膜)洗4次,每次10~15 min。 5. 用封闭液稀释HRPO或AP抗Ig抗体偶联物。
6. 将膜放进一新的可密封塑料袋子,加入稀释的HRPO抗Ig抗体偶联物。在室温持续揺动30~60 min。
7. 从塑料袋中取出膜,并按步骤4冼膜,按合适的显迹方法处理膜。 |
实验材料 | |
---|---|
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1. 在旋转摇床或摆动平台中持续摇动使膜与合适的封闭液平衡。对于硝酸纤维素膜或PVDF膜,需在室温封闭30~60 min。尼龙膜则需在37℃封闭2 h。
2. 用TTBS溶液(用于硝酸纤维素膜或PVDF膜)或TBS溶液(用于尼龙膜)稀释第一抗体。 3. 从封闭液中取出膜,放入第一抗体溶液中。于37℃缓慢摇动30 min。 4. 在TTBS或TBS中洗膜3次,毎次超过15 min。 5. 稀释2滴生物素酰化第二抗体于50~100 ml TTBS或TBS溶液以制备第二抗体工作液。 6. 将膜移入第二抗体工作液。室温中缓慢摇动30 min,然后按步骤4洗膜。 7. 当膜还与第二抗体共育吋,制备亲和素-生物素酰化HRPO或AP的复合物。将2滴Vectastain A试剂和B试剂混合于10 ml TTBS或TBS中,室温故置30 min,然后,进一步稀释于50 ml TTBS或TBS。 8. 将膜移入亲和素-生物素酰化的酶溶液中。室温中慢慢摇动下放置30 min,按步骤4洗膜,但每次超过30 min。 9. 按合适的显迹方案显影。 |
实验材料 | |
---|---|
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1. 在室温以PBS洗膜15 min 以去除过量的磷酸盐和Tween 20。
2. 将膜放入发色底物显迹液,条带应在10~30 min 内出现。 3. 用蒸馏水洗膜,终止反应。晾干后拍照留永久的记录。 |
实验材料 | |
---|---|
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1. 用50 ml 底物缓冲液洗膜两次以平衡膜,每次15 min。
2. 对于使用硝酸纤维素膜或PVDF膜进行的碱性磷酸酶反应:膜置于Nitro-Block溶液中5 min,然后以50 ml 底物缓冲液洗5 min。
3. 将膜移入显迹液中,浸泡30 s 或5 min。
4. 取出膜,滴干水份,将膜正面朝下放在一张透明的塑料保鲜膜上,向后折叠用保鲜膜将膜紧密包裹起来。
5. 在暗房中,将膜正面朝下放在感光胶片上,曝光时间取决于样品,放射自显影几秒或过夜。
6. 如果需要,可用50 ml TBS溶液洗膜15 min,再进行发色显迹。
|
更有优质直播、研选好物、福利活动等你来!
本网站所有注明“来源:丁香园”的文字、图片和音视频资料,版权均属于丁香园所有,非经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,授权转载时须注明“来源:丁香园”。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理。
我的询价