标签: 限制性内切酶 消化 DNA
限制性核酸内切酶消化DNA实验可以用于(1)核酸内切酶大多数来自于细菌体内,与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰体系,限制外源DNA、保护内源DNA。(2)将酶切后的片段连接到载体上。
11 收藏 2150 阅读
1. 混合下列溶液于一个无菌的微量离心管中
(1)x μl DNA
(2)2 μl 10×酶切缓冲液
(3)18-x μl H2O
(4)20 μl 的反应体积可以方便地用于聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分析。
(5)只要反应混合物中其他成分的比例保持一定,可增减待切割DNA的量和反应条件。
2. 加入限制性内切酶(1——5 U/μg DNA)在推荐的温度温育1 h (—般是37℃)。
3. 理论上,1 U 限制性内切酶在推荐的反应条件下,60 min 内可完全消化1 μg 纯化的样品。
4. 酶的体积应低于反应总体积的1/10,因为酶液中的甘油可以干扰反应。
5. 加入5 μl 电泳加样缓冲液终止反应,进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
6. 反应也可通过加入0.5 μl 0.5 mol/l EDTA(终浓度为12. 5 mol/l) 以螯合镁离于而终止。
7. 很多酶再65℃温育10 min 可被不可逆灭活,有些不能在65℃热失活的酶在75℃温育15 min 也能失活。
8. 如果酶对热具完全抗性,可遍过酚抽提和乙醇沉淀或通过硅基质悬浮法来纯化DNA。
1.分子克隆是微量操作技术,DNA样品与限制性内切酶的用量都极少,必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。
2.要注意酶切时加样的次序,一般次序为水、缓冲液、DNA各项试剂,最后才加酶液。取液时,Tip头要从溶液表面吸取,以防止Tip头沾去过多的液体与酶,待用的内切酶要放在冰浴内,用后盖紧盖子,立即放回-20℃冰箱,防止限制性内切酶的失活。
3.凡用在酶切反应中的一切塑料器皿(Eppendorf管,Tip头等),都要新的,最后用重蒸水清洗,湿热灭菌,置50℃温箱中烘干,使用前打开包装,用镊子夹取,不直接用手去拿,严防手上杂酶污染。
4.当样品在37℃与65℃保温时,要注意:
(1)防止因盖子未盖严密使水汽进入管内,使反应溶液体积大量增加,造成实验失败。
(2)防止由于标签脱落,分不清样品类型。
5.由于温差原因,往往在盖上有水汽,因此样品酶切完毕或中间取样电泳要离心2秒钟,以集中体积内溶液,否则会发现酶切后体积少了。
限制性内切酶进行酶切DNA实验时DNA必须是纯化的吗?
我们在做酶切实验时,没有将DNA进行纯化,酶切后跑电泳结果发现出现两条带,但是下面的带不是很清晰。我们分析了很多的原因,而且重复很多次都是这样的,不知该怎么办好?
2 评论
更有优质直播、研选好物、福利活动等你来!
本网站所有注明“来源:丁香园”的文字、图片和音视频资料,版权均属于丁香园所有,非经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,授权转载时须注明“来源:丁香园”。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理。
DNA 限制性消化分析|DNA Restriction Digestion Analysis
艾美捷科技有限公司
钻石会员 入驻 15 年
Dpn I限制性内切酶 (甲基化模板消化酶)
翌圣生物科技(上海)股份有限公司
钻石会员 入驻 17 年
大片段DNA的分析和回收、凝胶内PCR反应(In-gelPCR)、 凝胶内(In-gel)连接和转化实验、DNA和RNA的消化
苏州瑞诺德生物科技有限公司
钻石会员 入驻 7 年
我的询价
询价列表
暂时没有已询价产品
手机验证
科研好物关注研选号