1. 基因组DNA限制性内切酶酶切
(1)设置50 ul 反应体系,在200 ul EP管中加入:
10 ug 基因组DNA |
x ul |
去离子水 |
49-x ul |
10×buffer |
5 ul |
EcoR Ⅰ |
4 ul |
(2)充分混匀,离心20 s。
(3)置于PCR议上37℃反应过夜。
(4)加1/10体积乙酸钠、2体积无水乙醇沉淀DNA晾干。
(5)加20 ul TE buffer溶解DNA。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳
(1)用0.5xTBE buffer配制0.8%琼脂糖凝胶,微波炉加热至溶化,加入EB(0.5 ug/ml)混匀后倒入制胶器中室温凝固。
(2)凝固后,去除样品梳及胶带,置于水平电泳仪中。
(3)将DNA样品用6xDNA landing buffer 混匀后加入样品孔中,恒压电泳(20 V/10 mA)直至染料电泳至边缘。
(4)电泳完毕,取出凝胶切角并在凝胶成像系统成像记录。
3. DNA转移与固定
(1)凝胶置于0.25 M HCl中处理30 min,去离子水洗1次。
(2)碱变性:凝胶置于0.4 M NaOH变性液中作用20 min。
(3)毛细管法转移:根据凝胶大小裁剪与其等大小尼龙膜、滤纸片,尼龙膜一角软铅笔作方位标记。
(4)去离子水浸泡尼龙膜、滤纸片,中再浸泡5 min。
(5)按下图安装转移槽进行转移过夜(0.4 M NaOH转移液)。
(6)转移完毕后取出尼龙膜,2xSSC浸泡5 min,滤纸吸干,夹在2层干净滤纸。
4. 预杂交与杂交
(1)预杂交:将尼龙膜置于预热DIG Easy Hyb工作液(37℃~42℃)中摇晃充分作用30 min。
(2)探针变性:DIG标记探针煮沸5 min 后迅速置于碎冰中,用预热DIG Easy Hyb工作液制备含探针的杂交液。
(3)弃去预杂交液,加入杂交液42℃摇动孵育4小时或过夜。
(4)2xSSC(in 0.%SDS)洗膜2次(5 minx2),不断摇动。
(5)5xSSC(in 0.%SDS)洗膜2次(155 minx2,65~68℃),期间不断摇动。
5. 杂交检测
(1)Washing buffer润洗1遍(3~5 min)。
(2)100 ml blocking buffer工作液封闭30 min。
(3)100 ml antibody buffer(1:5000)孵育30 min。
(4)Washing buffer洗膜(15 minx2)。
(5)20 ml detection buffer 平衡2~5 min。
(6)将尼龙膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中,避光数min至1天(出现颜色时不要摇动)。
(7)当出现条带时,TE-buffer洗膜(5 minx1),终止现色。
(8)照相记录,80℃烤干,储存。
(9)扫描计算EGFR基因扩增的倍数。
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