标签: 抗药 基因
多药抗药基因的表达实验主要用于肿瘤治疗研究。
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大多MDR细胞膜上出现MDR-1基因及其基因产物P-糖蛋白过度表达。 多药抗药基因的表达实验是通过反转录和PCR的方法来检测这些特定基因的过度表达。
一、细胞总RNA提取 1. 收集约5x107个细胞,冷PBS洗涤。 2. 加入400 ul RNA提取液(含6 mol/l 的异硫氰酸肽,0.5%十二烷基肌酸钠,0.025 mol/l 构橼酸钠pH7.0,0.25 mol/l 乙酸钠,pH4.0,0.5%二疏基乙醇,50%萘酸),混匀。 3. 加入400 ul 氯仿,混匀,以13 000 r/min 于4℃离心15 min。 4. 取上清液加入等体积的异丙醇,4℃放置30 min。 5. 然后以13 000 r/min 离心15 min,吸上清,将RNA成点用75%的乙醇洗涤1次,溶于100 ul 的无菌双蒸馏水中。 6. 并用紫外分光光度计检测RNA纯度(A260/A280应为1.8~2.0)后备用。 二、反转录及PCR扩增 1. 引物
1. 尽可能在低温下操作;
2. 适量斟酌Trizon等的用量;
3. 在每一次离心后除尽蛋白质、不溶物
提取操作时必须戴手套、口罩等防止DNA酶的影响;
4. 注意Trizon带有腐蚀性;
5. 最重要的就是防止DNase的污染,手套、口罩必不可少,所用的枪头和EP管等也要RNA提取专用的,无DNA酶的。
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