1. 实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10 mL加80 ul,50 mL中加入300 ul)。
2. 取约0.8 g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可,固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8 mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀。
3. 65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次。
4. 加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(10 000 rpm,4℃,5 min)。
5. 取上清,等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提(10 000 rpm,4℃,5 min)。
6. 加入1/4V体积10 M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)。
7. 10 000 rpm,4℃离心20 min。
8. 弃上清,用500 ul SSTE溶解沉淀。
9. 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提两次,氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10 000 rpm,4℃,5 min)。
10. 加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30 min以上。
11. 12 000 rpm,4℃离心20 min。
12. 弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥。
13. 加200 ul的DEPC处理水溶解。
14. 用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数。)
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