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小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验

标签: 小鼠 腹腔 巨噬细胞 原代培养

小鼠腹腔巨噬细胞原代培养可应用于:(1)细胞保种;(2)分子生物学研究;(3)基因治疗研究。

实验方法
  • 腹腔取材法
实验方法原理
巨噬细胞属免疫细胞,有多种功能,是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群,在条件适宜下可生活2-3周,多用做原代培养,难以长期生存。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、实验材料准备
 
1.   动物:各个品系的小鼠2-4只。
 
2.  试剂:RPMI1640培养基(含酚红),小牛血清,双抗,培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗),台盼兰等。碘酒绵球和酒精绵球。
 
3.  器械:一次性注射器、手术器械。
 
二、实验方法
 
如果采用刺激物,则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL,获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物,直接开始下面的步骤。
 
1.  拉颈处死小鼠,在75%酒精浸泡1-2分钟,移入超净台中,仰卧位固定于解剖板上,碘酒消毒腹部皮肤,酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤,暴露腹部肌层,再用酒精绵球消毒腹部肌层。
 
2.   用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔,用绵球轻揉腹部1-2 min,然后,用眼科镊稍提起腹腔,并用眼科剪剪开一个小口,用吸管吸取细胞悬液,移入离心管中(个人认为,此法比用注射器抽吸好一些)。
 
3.  1 000 rpm离心5 min后,用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次,再次离心,重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中,如果是作为饲养细胞使用,则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法计数,将细胞稀释到目的浓度后,接种即可。
 
4.  如果是作为饲养细胞使用,调整浓度至2x105个/mL,接种到96孔板中,每孔100-200 μL;如果作为其它实验使用,可以调整成2x106/mL,加到24孔平底培养板中,1 mL/孔;5% CO2温箱孵育2 h后,换液,并用RPMI1640培养基洗1-2次,弃去未粘附细胞,贴壁细胞为单层的巨噬细胞。
 
三、 结果
 
巨噬细胞刚贴壁时偏圆形,或者类似鹅卵石形状,然后慢慢伸出伪足,铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性,当与细菌混合在一起的时候,在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌,因此,巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。
 
 
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注意事项
1.  巨噬细胞是终末分化细胞,不会增殖。

2.  很难消化下来,所以接种的时候,必须直接接种到目的培养器皿中。
 
3.  严格无菌操作,在超净台内进行。

4.  为避免交叉感染,每一只小鼠更换注射器。

5.  吸管吸取细胞悬液的时候,尽量不要吸到大小肠,否则容易引起成纤维细胞污染。
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其他
巨噬细胞刚贴壁时偏圆形,或者类似鹅卵石形状,然后慢慢伸出伪足,铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性,当与细菌混合在一起的时候,在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌,因此,巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。
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