冰冻切片的制作技巧及心得(一)

冰冻切片的制作技巧及心得(一)

关键词: 冰冻切片

来源: 丁香园

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下面发一个有关冰冻切片制作的资料,来自于国外病理医生的经验和心得,现翻译过来供大家参考,欢迎提出不同的见解。

冰冻切片技术

1.从锋利的刀片开始

我发现使用新的锋利的刀片时常常做出高质量的片子。我觉得在医疗场合中某些尽量省钱的做法显得有些因小失大。一般我对每位患者的标本都使用一组新的刀片,当片子的质量开始下降时,我会立刻更换刀片。某些组织如质地较硬的胶原和钙化组织会使刀片很快变钝,因此,经常更换刀片显得很有必要,有时候我在切片过程中要连续更换2-3次刀片。

2.坐着还是站着

我切片时总是坐在一张凳子上。要学会把刷子作为一种便捷的辅助工具来操作,从而精细地控制显微厚薄程度的片子。切片时俯身弯腰,颈部过伸的姿势有些不妥,要尽量处于放松和舒适的姿势以便能最大程度控制你的左手。

3.刷子

我是一位刷子的使用者。我相信要想切好片子首先学会使用刷子。刷子的作用就在于粘住片子并把片子弄到台子上。冷冻的片子会自发的卷缩并从刷子上脱离下来,因此,我使用一把有硬毛、夹取面宽的刷子。我发现来自中国的野猪毛十分坚硬,非常管用。你可以花3美元从工艺店买一把1/4英寸长的#2号扁平无色的刷子,把毛削成一个角度。由于是个有角的头端,加上握持刷子成一定的角度,这样刷子与组织接触时就会象扫帚一样的平。我不能理解为什么有人使用脆弱的骆驼毛刷子,组织片很容易从这些柔软的毛上掉下来。



4.握持刷子

左手象拿笔一样握持刷子,将第五指轻压于台面上以稳定握笔的手(或根据手和切片机尺寸的大小置于你感觉合适的地方),这样可以保证操作者动作的灵活及可控性。我把刷子削成一个角度,大致与左手握持刷子的角度相同,这样使刷子平着接触组织的1/4。


5.摇柄的旋转

以连续均匀的力量转动切片机的摇柄,且要毫不犹豫。我看到很多冰冻切片者手握着刷子在开始切片时总要停一下,缓慢的抓取组织,然后再开始转动摇柄。依我的经验看来,这种动作增加了起始切片假象的可能,会使片子的厚度不均匀,也增加了处理脂肪类组织的难度。我切片时,象前面所说的那样手握刷子,以一种连续的动作抓取组织,这个动作与刀片接触组织同时开始并贯穿于整个过程。

6.刷子的移动

组织块移向刀片时刷子也要同步地向下移动,当组织块刚好接触刀片时刷子轻轻停在其底部2mm处并迅速抽离。正是刷子的向下移动使你能连续地抓取组织,当开始的几毫米组织穿过刀片时便有自发卷曲的现象,这时,运动中的刷子立刻粘住其游离的边缘部分并水平地拖向切片者。刷子的运动路径是一个朝下的“肘”形,然后再朝向你自己,连续不断。但要注意有时候把组织压向台面时会使组织粘在台面上,可能会导致碎片,应尽量避免。当然预先将组织包埋起来可以使刷子不用接触到组织,切片也容易多了。


7.贴片

可以从切片机的台面上也可直接从组织块面粘贴组织片,我一般采用前者。片子切好后,手持玻片在片子上方,向下以一个角度粘住片子的一角,在静电作用下片子会吸附在玻片上并迅速融化。当然在周围涂一些包埋物对贴片有利,这种多余的包埋物可以保护片子的边缘免受皱缩的损坏。有时候碰到贴片困难,我会在切到最后2mm包埋物的时候停下来,让片子留在组织块上,然后倒转摇柄,使组织块退离刀片,再用刷子从边缘把组织片摊平,这样就可以从组织块面贴片了,这对卷曲的片子或者脂肪组织非常管用。

8.快速固定

我右手转动摇柄也同时拿着玻片,片子一切好,立刻粘起片子并将它浸没于固定液中。固定液需置于方便够到的地方,我一般将染色架放在染色缸的旁边,先将片子置于95%的乙醇溶液中固定,然后插于染色架上。如果组织固定延迟会出现风干的假象,我的经验是组织片还在切片机的台面时,风干效应很小,当组织片粘在有温度的玻片上时就会出现明显的风干假象,表现为核的细节丢失及胞浆液的溢出。下面几张图片是延迟15秒固定和立刻固定的相同组织的比较,差异非常明显。


9.切片的厚度

对于一般的手术病理我推荐切6um厚,这种厚度使染色更加饱满,层次清晰,病理学家通常在2x 和 4x的放大倍数下可以获得更多的信息。太薄的片子在这种放大倍数下显得苍白,容易忽略一些细节。6um的片子可以有更多的时间去避免风干假象,也会减少冰晶所造成的细胞核空洞。当然特殊情况下可能需要更厚或更薄的片子。

10.为什么会掉片

我不能确定组织片粘附到玻片的具体机制,但我相信可能与组织内的液体与玻片发生分子交联有关。下面我例出几种染色过程中组织片脱落的情况:

1)本身非常干燥或过度脱水的组织;

2)组织片的周长与面积比过大,象细条形的组织容易受染色缸内液体涡旋应力的影响而脱落,同样包括薄的纤维囊肿及不规则的坏死组织,太厚的组织也不例外;

3)反蓝用的氨水浓度太高;

4)少数情况需要使用100%的乙醇固定;

5)一张玻片贴多个片子时,片子周围的包埋物相互重叠。

感谢战友:llusion   ,原文详见:http://www.dxy.cn/bbs/topic/15782788

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