关键词: 共焦 显微镜 基本原理
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激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)是在荧光显微镜成像基础上配置激光光源和扫描装置,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦装置,利用计算机进行图像处理,对观察样品进行断层扫描和成像,是一种高敏感度与高分辨率的显微镜,在生命科学领域的组织、细胞 和分子水平研究中的应用十分广泛,主要用于样品荧光定量检测,共聚焦图像分析,三维图像重建、活细胞动力学参数分析和细胞间通讯等方面研究。
激光扫描共聚焦显微镜以激光作为光源,激光器发出的激光通过照明针孔形成点光源, 经过透镜、分光镜形成平行光后,再通过物镜聚焦在样品上,并对样品内聚焦平面上的每一点进行扫描。
样品被激光激发后的出射光波长比入射光长,可通过分光镜,经过透镜再次聚焦,到达探测针孔处,被后续的光电倍增管检测到,并在显示器上成像,得到所需的荧光图像,而非聚焦光线被探测针孔光栏阻挡,不能通过探测针孔,因而不能在显示器上显出荧光信号。这种双共轭成像方式称为共聚焦。因采用激光作为光源,故称之为“激光扫描共聚焦显微镜”。
激光扫描共聚焦显微镜通过对样品X-Y轴的逐点扫描,形成二维图像。如果在z轴上调节聚焦平面的位置,连续扫描多个不同2位置的二维图像,则可获得一系列的光学切片图像。在相应软件的支持下,通过数字去卷积方法(deconvolution)得到清晰的三维重建图像。正因为激光扫描共聚焦显微镜能沿着z轴方向在不同层面上获得该层的光学切片,所以可以得到组织细胞各个横断面的一系列连续光学切片,实现细胞“CT”功能。
激光扫描共聚焦显微镜原理模式图
激光扫描共聚焦显微镜二维图像
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