关键词: 表达蛋白 生物学活性 检测
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一、MTT比色法检测细胞活性
(一)原理
活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT形成蓝色的甲肷,其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。对 细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT比色法进行。
(二)试剂准备
1、 青链霉素溶液(100X):青霉素100万U,链霉素100万U,溶于100mlddH2O中, 抽滤除菌。 2、 L15基础培养基:1000mlL15培养基,加2g碳酸氢钠,10ml 100X青链霉素,5mlHEPES。 3、 MTT液:5mg/ml溶于L15基础培养基。 4、 SDS处理液:20gSDS,50μl二甲基甲酰胺,加双蒸水50ml溶解。 5、 L-多聚赖氨酸:50μg溶于1ml双蒸水中。 6、 L15基础培养基溶解的不同浓度的蛋白液。
(三)操作步骤(以背根神经节细胞培养为例)
1、 无菌条件下取新生一天的SD大鼠背根神经节(DRG)。 2、 镜下去除神经根和外膜,放入1ml 0.1%胶原酶中37℃消化30min,每5min摇匀一次。 3、 洗去胶原酶,吹打分散后,接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中,每孔含100μl无血清L15培养基,细胞约800个。 4、 实验组分别加入纯化的表达蛋白(分别以不同的蛋白浓度),阴性对照加入等体积表达蛋白的溶剂。 5、 37℃ 5%CO2培养48hr后,每孔加入10μl MTT,37℃ 5%CO2孵育4hr。 6、 加入100μl 20%的SDS处理液,37℃孵育20hr。 7、 用EL×800微孔酶标仪测定OD570值,数据分析。
二、DRG无血清培养检测促神经生长作用
(一) 操作步骤:
1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠DRG。 2、镜下去除神经根和外膜,接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中,每孔1个DRG。 3、待DRG贴壁后加入100μl无血清L15基础培养基,实验组加入纯化的表达蛋白(分别以不同的蛋白浓度),阴性对照加入等体积的溶解表达蛋白的溶剂。 4、37℃ 5%CO2培养,每天在Olympus倒置显微镜下观察细胞的生长情况,并进行测量,其数据作统计分析。
(二) 注意事项:
1、MTT有毒,注意防护。 2、单个DRG贴壁实验操作难度较大,需仔细耐心。
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