关键词: 单向免疫琼脂扩散 双向免疫琼脂扩散 免疫电泳
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可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时,在一定温度和电解质存在的条件下,经过一定的时间,形成肉眼可见的沉淀物,称为沉淀反应。沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、脂类等。
根据抗原与抗体的不同条件及其它因素,沉淀反应可以分为以下三种主要形式。即:环状沉淀反应(ring precipitation reaction),凝胶中沉淀反应(precipitation reaction in gel),如单向扩散、双向扩散、对流电泳、免疫电泳以及微生物学实验中的絮状沉淀反应(flocculation precipitation reaction),如梅毒血清检验中的康氏(Kahn)及克莱氏(Kline)试验以及检测白喉杆菌毒力的体外试验-Elek氏试验,检测毒素或类毒素的絮状沉淀单位测定等。本实验主要介绍凝胶中的沉淀反应。
(一)单向免疫扩散(Single immunodiffusion)——人群血清IgG正常值测定
一、基本原理
在含有特异抗体的琼脂板中打孔,并在孔中加入定量的抗原,当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合,即形成白色沉淀环,其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线,即可用以定量检测未知标本的抗原浓度(mg/ml或U/ml)。
应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM的水平。
二、实验材料
2%离子琼脂或生理盐水琼脂(采用0.9%的生理盐水,内含0.1% NaN3)。 标准马抗人IgG血清(抗体)(北京生物制品研究所生产) 工作标准参考蛋白(北京生物制品研究所生产) PBS (pH7.2,0.01M). 打孔器(孔径3mm)及打孔模板 微量加样器 湿盒(容器内加湿纱布或泡沫塑料) 已制备好的含有1%马抗人IgG抗体的琼脂板 稀释的单人份待检血清标本(浓度分别为1/30、1/40和1/50)
三、实验方法
(一)标准曲线的制备:示教 1.按照玻片的大小,准备制做琼脂板所需要的1%离子琼脂。首先分装其1/2量的2%盐水琼脂,例如,用普通载玻片制做时需1%离子琼脂4ml,在分装2%盐水琼脂时即为2ml。溶化后置56℃~60℃水浴中平衡温度备用。 2.稀释抗体,用pH7.2的PBS稀释标准抗人IgG抗体,终浓度为抗体效价的一倍。例如,血清效价为1/140,原浓血清即应按1/70稀释。并分装试管,其分装量应与2%盐水琼脂量相等。 3.制备琼脂板:将已稀释的抗人IgG抗体于56℃水浴中预热约半分钟,再倾注于已溶化并维持56℃~60℃的2%盐水琼脂管中,用拇指将管口堵紧。翻转试管1-2次,将抗体与琼脂混合均匀(注意:抗体与琼脂混合时切勿产生气泡),即刻倾注于玻片上,待凝固后即可。 4.打孔:将琼脂板置于模板上,在同一直线上用打孔器打孔5个,孔距10mm。 5.稀释不同浓度的标准参考蛋白(工作标准):应根据制品说明进行稀释,例如:工作标准中免疫球蛋白含量,IgG为100单位/ml,80.4微克/单位,其稀释范围为1/10、1/20、1/40、1/80及1/160。 6.加样:将已稀释的不同浓度的工作标准蛋白依次用微量加样器每孔加入10ul(注意:每一稀释度均应更换塑料吸头)。 7.将加样的琼脂板放湿盒中,置37℃温箱,24小时后观察结果。 8.用量角规测量并记录沉淀环直径,然后以沉淀环直径为纵座标,以标准参考蛋白量(单位/ml)为横座标,绘制成标准曲线。
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