高效毛细管电泳(high performance capillary electriphoresis,HPCE)上在传统电泳基础上继现代高效液相色谱技术之后发展起来的一种新型高效分离技术,由于它具有无法比拟的高效和快速性,因而受到越来越多科学家们的青睐。
一、毛细管电泳的发展史
1967年在高电场作用下,以3mm直径的毛细管内进行自由溶液的区带电泳,1974年报道了以200~500um内径玻璃毛细管内进行的区带电泳分析,早期的研究受当时检测灵敏度的影响,未获预期的高效分离效率,但为毛细管电泳分离的发展奠定了基础。
1981年人们第一次展示了毛细管区带电泳,使用75um内径的玻璃毛细管和荧光检测器进行在线检测,在30KV电压下,分离了氨基酸和多肽类物质,塔板数高达40万,这一工作被认为是现代毛细管电泳发展的里程碑。1983年将聚胶柱制备困难的缺点。
1984年使用含有表面活性剂的背景电解质,开辟了毛细管电泳另一个重要分支-胶束毛细管电动力学色谱。1987年又结合传统的等电聚焦电泳和凝胶电泳原理,并移到毛细管内进行电泳,1988年实现了微量制备的可能性,提取和分离了50umol的蛋白质、肽和寡核苷酸等。
80年代未,国内外毛细管电泳的研究非常活跃,于1989年推出第一批毛细管电泳仪,90年代起在技术和仪器应用等方面都有了很大的发展,1990年改进和应用了紫外检测器,1992年激发诱导荧光检测器诞生,毛细管电泳技术得到不断改进和更新,敏感度和分辨率均达到预期的高效分离效率。
二、高效毛细管电泳的基本原理
粒子在电场的作用下,以不没的速度向电荷反方向迁移和现象,是一种在空芯、微小内径的毛细管(内径10~200um)中进行的大、小分子的高效分离技术,毛细管两端分别浸入缓冲液中分别插入连有高压电源的电极,该电压使得分析样品沿毛细管迁移。
根据被分离物之间电荷和体积的不同,各种分子在高电压下被分离,在自由区带毛细管电泳中,电泳的移动(带电荷分子朝相反极性的电极方向移动)和电渗流(在毛细管内壁上的电荷和应用的势能而引起的电解质移动)导致了分离。
电渗流的大小取决于电场强度、电解质的PH、缓冲液的组成和离子强度、内磨擦和毛细管表面的等特点,这些因素能单一或互相结合地提高分离效果,检测可使用UV直接通过毛细管上的小窗口进行检测,也可选择激光诱发荧光、二极管阵列、电化学和质谱检测器检测。
样品进样方式是应用气压或电压将样品压入毛细管中完成。高效毛细管电泳具有多样化分离模式,其分离的机理是不同的,它们之间具有相互补充的作用。
三、 高效毛细管电泳的分离模式
1、毛细管区带电泳(Capillary Zone Electroporesis,CZE)
分离原理:毛细管区带电泳出称为自由溶液毛细管电泳,是毛细管电泳是最简单的一种形式。其分离机理是基于各被物质的净电荷与质量之间比值的差异,不同离子按照各自表面电荷密度的差异,以不同的速度在中解质中移动而导致分离,它要求缓冲液具有均一性。
毛细管内各处具有恒定的电场强度,是目前应用最广的一种分离模式。适用于蛋白质、氨基酸、多肽类和离子的分析。毛细管中除电解液外,无需填充任何物质,操作容易,自动化程度高。
2、毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
分离原理:凝胶电泳是凝胶移到毛细管中用为支撑物进行分离的区带电泳。凝胶是一种固态的分散的体系。具有多孔性,类似于分子筛的作用,被分离物在通过装入毛细管内的凝胶力,按照各自分子的体积大小逐一分离。
分子体积大的首先被分离出来,适用于生物大分子的分析,可纯粹按分子体种大小进行分离(SDS-PAGE),以决定蛋白质的分子量,可以识别一个碱基差异的寡核苷酸,可分离DNA片段,如微卫星(STR)分析,可改变凝胶的浓度不控制分离的范围,如PCR产物的分析。