免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)实验方法
免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)基本实验步骤:(1)收获细胞,加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清;(2) 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;(3)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-b ...
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染色质免疫共沉淀技术(ChIP)
真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉 ...
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Western实验步骤
对于Western Blotting实验而言,样品处理是关键步骤之一,获得的蛋白样品必须均质、可溶,并解离成单个多肽亚基,且尽量减少相互间的聚集,使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。当目标蛋白的含量很低时,需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器(如核抽提物),或者通过免疫沉淀等方式进行富集。通常样品有重组蛋白、细胞和组织等。
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染色质免疫共沉淀CHIP 超声问题集锦
本文摘自丁香园论坛:http://www.dxy.cn/bbs/thread/21866348#21866348问题:最近要做CHIP,有一点疑惑:如果超声过程正好把目的基因断开,PCR时应该就检测不到目的基因了啊!有这样的情况吗?解答:1. 超声要摸条件,使DNA 片段大都控制在300-500bp(其实200-800bp也可以的),太小了基本都打断了,没法PCR。2. 设计PCR引物时,产物的长度不要太长100多就可以,产物太长不容易 ...
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