关键词: 还原型谷胱甘肽 GSH 氧化型谷胱甘肽 GSSG 测定
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GSH和GSSG 参照 Anderson等 (1992)。取0.5 g样品,加入3 mL冰冷的6%的偏磷酸(含1 mmol•L-1 EDTA , pH 2.8),冰浴研磨,匀浆液以20,000 g,4 ℃离心15 min,取上清液来马上测定GSH和GSSG的含量或储存在-20 ℃下等待测定。总的GSH和GSSG含量测定如下:200 μL提取液加 1.2 mL反应液包含400 μL反应液1(110 mmol•L-1 Na2HPO4•7H20, 40 mmol•L-1 NaH2PO4•H2O, 15 mmol•L-1EDTA, 0.3 mmol•L-1 5,5‘-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) DTNB, 0.04% BSA)、320 μL反应液2 (1 mmol•L-1 EDTA, 50 mmol•L-1 imidazole 咪唑solution and 0.02% BSA)、 400 μL反应液3(5% Na2HPO4, pH 7.5的溶液稀释50倍)、80 μL 9.0 mmol•L-1 NADPH。
测定OD412下的吸收值。GSSG含量测定如下:200 μL提取液加入1 mL的2-2乙烯嘧啶(稀释50倍)在25°C下水浴1 h再测定OD412下的吸收值。GSH的含量可以从总的GSH和GSSG含量中减去GSSG含量获得。
GSH测定方法:取样品0.5 g,加入预冷的5%磺基水杨酸2.5 ml和少许石英砂,充分冰预研磨,转入离心管中,于4℃下20,000×g离心20min,将上清液分装,液氮冷冻后于-20℃ 保存或直接进行抗氧化剂分析。
取50 μL上清液,用5% 磺基水杨酸定容至100 μL (即加入5% 磺基水杨酸50 μL),加入24 μL 1.84 mol•L-1三乙醇胺triethlene diamine以中和样液,加入50 μL 10% 乙烯吡啶Polyvinyl pyridine (用70% 乙醇配制),25℃水浴1 h,以除去GSH,到时加入706 mL 50 mmol•L-1磷酸缓冲液,pH 7.5,内含2.5 mmol•L-1 EDTA,加入20 μL 10 mmol•L-1 NADPH 和80 μL 12.5 mmol•L-1 DTNB(二硫硝基苯甲酸),混匀,25℃保温10 min,到时加入20μL 50 U•mL-1 GR,总体积为1 mL,立即混匀,读出3 min时的OD值。此法用来测定GSSG,总的谷胱甘肽(GSH +GSSG)的测定,只要把上述的乙烯吡啶用等体积的蒸馏水替代即可。以5% 磺基水杨酸为溶剂,用同样的方法制作GSSG标准曲线。
叶绿素含量的测定参照Arnon(1949)的方法。从选取第二片完全展开叶,剪碎,称取0.1 g置于研钵中,加少量80%丙酮研磨成匀浆,定容至25 mL,摇匀并置于避光处,待残渣发白后过滤,以80%丙酮作为对照,在663 nm 和645 nm下读取OD值。样品中叶绿素含量(mg•g-1FW)的计算公式为:叶绿素a含量=0.25(12.7OD663-2.69OD645);叶绿素b含量=0.25(22.9OD645-4.68OD663)。
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HUVEC做transwell迁移实验膜上没有细胞
最近在做transwell预实验,用的Millipore transwell小室,8um孔径,说明书说不用铺胶,每孔10万个细胞,试了不同的培养时间,用结晶紫或DAPI染色后,发现膜上都没有细胞,只有类似下图中的圆圈,看着也不是细胞,加了因子的实验组圆圈数量要比对照组多。初次做这个实验,不知道是什么原因,恳请高手帮我分析一下。
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因为看有些资料做的是取0.5g
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