关键词: 酵母基因组 抽提 方法
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问:我电转化的酵母抽基因组后做PCR鉴定,本就有颜色筛选的,应该成功率很大的啊,可是我鉴定了无数个克隆,就是拉不出PCR来。难道抽基因组的方法很关键吗?有的文献甚至用菌落做PCR,是不是骗人的啊?
我是用蜗牛酶(鼎国)破壁,再冻融几次,然后用SDS做用一会后加入蛋白酶K,数小时后酚氯仿作用,离心取上清后沉淀DNA,溶解后加RNA作用后,再酚氯仿抽提一次。不知是否有问题?谁有好的方法?
答:如果做地是短片断PCR(小于1.5kb),用菌落PCR完全可以,而且在筛选时可省去许多时间,用抽基因组做PCR鉴定,太耗时了。我给你一个做菌落PCR的protocol,我是用这种方法做的,很好用!具体方法:
①take cells from a fresh plate (it doesn't work as well if the plate comes out of the fridge)
②with a small tip resuspend a little bit of a yeast colony (not the whole colony) in 25 µl PCR mastermix
③run PCR with the following parameters:
1、 95 °C, 5 min
2.、95 °C, 30 sec.
3、50-55 °C, 30 sec.
4、72 °C, 1min/kb
5、72 °C, 3 min
run 35 cycles (steps 2 to 4)
④load the whole reaction on agarose gel
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