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UltraMAB 如何用 17K 蛋白芯片验证抗体

关键词: 抗体 蛋白芯片 免疫学 2017-11-24 11:51 来源:傲锐东源 点击次数:440

抗体是生物学研究中的最常用的一种工具,广泛应用于与免疫检测相关的研究技术中,包括酶联免疫吸附检测、免疫印迹、免疫沉淀和免疫组化等。同时,抗体也是临床监控的重要工具,可用于相关的诊断和治疗。

然而,近年来,科学家们发现,抗体相关研究一直存在严重的「重现危机」。研究使用的抗体在质量和性能一致性方面存在巨大的差异,对生物医学研究的可重复性造成了显着的不良影响。

而当抗体用于临床诊断时,如果出现非特异性交叉反应,则会出现意想不到的副作用和错误的诊断结果,抗体的特异性显得至关重要。

OriGene 为了应对整个抗体市场的信任危机,早在多年前就未雨绸缪,展开了一些列对于抗体特异性的探索和研发- UltraMAB® 超高特异性抗体就应运而生。

OriGene UltraMAB® 超高特异性抗体采用独特的 17k 蛋白芯片验证,OriGene 高密度蛋白芯片上包含 17,000 个 HEK293T 细胞蛋白过表达裂解物,每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过 Excel 文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为 40 个亚矩阵,每个亚矩阵上有一些参照,通过参照,可以定量每个芯片点上蛋白的含量,监控每次免疫反应数据的重复性,以及定位阳性信号的方向。

以下为使用 OriGene 蛋白芯片进行抗体鉴定实验的实验方法:

1、将一张蛋白芯片放在 50 ml 离心管中,使用 40 ml 去离子水浸润芯片,置于摇床上,室温混合 30 分钟。弃掉去离子水,使用 10 ml PBST 平衡芯片。室温处理 10 分钟。

2、向 50 ml 离心管中加入 40 ml 5% 脱脂牛奶 (用 PBST 进行稀释) 置于摇床上,室温封闭 30 分钟。

3、使用封闭液 (5% 脱脂牛奶) 稀释一抗,稀释比列:1:200。

4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上,滴加 250-300ul 一抗在封口膜上。

5、将蛋白芯片从封闭液中抽出,将蛋白芯片 NC 膜的一面朝下,从芯片的一边接触抗体,慢慢滑下,依靠液体表面张力,抗体将慢慢浸润芯片 NC 膜,直至整张 NC 膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到 4 度环境下,静置,一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖,其上黏附一张湿纸巾,以防止长时间孵育导致抗体蒸发。

6、第二天将芯片移至 50 ml 离心管中,使用 PBST 漂洗芯片两次,去除多余的抗体。使用 40 ml PBST(0.1% Tween-20) 洗涤芯片,置于摇床上混合均匀,洗涤三次,每次洗涤 5 min。

7、使用封闭液 (5% 脱脂牛奶) 稀释二抗,稀释比例为 1:400。

8、按照上述步骤 4,步骤 5 进行二抗孵育操作。室温孵育 1 小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖,以防止发生信号漂白。

9、按照上述步骤 6,使用 PBST 洗涤芯片。

10、使用去离子水冲洗芯片,以去除残余的盐分和变性剂。

11、室温干燥芯片,确保芯片完全干燥。

12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。

13、根据 BSA-Cy3 以及 BSA-Cy5 确定芯片方向以及阳性信号的位点。

14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液 ID,根据裂解液数据库信息,查找到对应蛋白名称,NCBI 录入号 (accession number),蛋白 ID,蛋白大小等信息。

实例结果如下图所示:


Figure1 The identification of the 8F1 cross-reactive protein with protein microarray chip and Western blot confirmation. A. Protein microarray hybridization with 8F1. The OriGene overexpression protein microarray chip was immunostained with the most commonly used 8F1 monoclonal anti-ERCC1 antibody. The positive reactive proteins are highlighted with red arrows. These data show that 8F1 recognizes not only its specific target (two ERCC1 transcript variants), but also another unrelated nuclear membrane protein PCYT1A. A number of internal controls were also labeled on the panel. B. Western Blot analysis. Seven OriGene VERIFY overexpression lysate antigen standards (Lane 1 to 7) were fractionated on SDS-PAGE, and then immunoblotted with 8F1 (Upper panel)。 The recombinant protein expression levels within the lysates were analyzed with anti-DDK antibody (Lower panel)。 Lanes 1 to 7 are loaded with samples for ERCC1 (NM_202001), ERCC1 (NM_001983), ERCC2 (NM_000400), ERCC3 (NM_000122), ERCC4 (NM_005236), ERCC5 (NM_000123) and PCYT1A (NM_005017)。


Figure2 To develop the most highly specific anti-ERCC1 monoclonal antibody with a protein microarray chip. A. Specificity evaluation with a protein microarray chip. The overexpression protein microarray chip was immunostained with the 4F9 clone. This data shows that 4F9 is highly specific to ERCC1 (indicated with red arrows)。 No cross-reactivity was observed with any other test protein. B. Western Blot confirmation analysis. Seven OriGene VERIFYTM overexpression lysate antigen standards (Lane 1 to 7) were fractionated on SDS-PAGE, and then immunoblotted with 4F9. The recombinant protein expression levels for the each of the different protein overexpression lysates were confirmed with the anti-DDK antibody (Figure 2B)。 Lanes 1 to 7 are loaded with samples for ERCC1 (NM_202001), ERCC1 (NM_001983), ERCC2 (NM_000400), ERCC3 (NM_000122), ERCC4 (NM_005236), ERCC5 (NM_000123) and PCYT1A (NM_005017)。

蛋白质阵列实际上并不是一个全新的概念,而 OriGene 的蛋白质芯片也并不是市场上唯一的。它和其他蛋白质阵列有什么不同吗?答案是肯定的。17K 蛋白阵列在单片机上拥有最多的蛋白质。它几乎在其他品牌的原始数组的蛋白质数量上增加了一倍。另一个不同的因素是,OriGene 的蛋白质阵列是从人体细胞中提取蛋白质,而不是来自昆虫细胞。

此外,OriGene 的蛋白质阵列对药物开发的热门靶点有更好的覆盖,如跨膜蛋白、GPCRs、离子通道和干细胞相关蛋白等。

参考文献

1.Donghui,Dror Baruch, Youmin Shu:Using protein microarray technology to screen anti-ERCC1 monoclonal antibodies for specificity and applications in pathology.BMC Biotechnology201212:88doi.org/10.1186/1472-6750-12-88.

2. Coleman MH, Bueno R: Role of adjuvant chemotherapy in NSCLC (stages I to III)。 Surg Oncol Clin N Am. 2011, 20 (4): 757-767. 10.1016/j.soc.2011.07.011.

3. Miller RP, Tadagavadi RK, Ramesh G, Reeves WB: Mechanisms of Cisplatin nephrotoxicity. Toxins. 2010, 2 (11): 2490-2518. 10.3390/toxins2112490.


编辑: 齐梦霞2
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