本文重点讲述 IHC 操作流程中的关键步骤,并提供数据以支持及解释 CST 在实验过程中所提的建议。最后,本指南列出了 CST 科学家内部常用且最适用于与抗体配套使用的 IHC 试剂。
抗原修复—热诱导的抗原表位修复 (HIER)
缓冲液
适用于 HIER 的缓冲液有多种。而 CST 常推荐的两种缓冲液是:pH6, 10 mM 柠檬酸盐缓冲液和 pH 8, 1 mM EDTA 缓冲液。缓冲液是否适用于您的实验取决于您所使用的一抗。请查阅产品说明书中所推荐的用于特异性抗体的修复缓冲液。一般而言,EDTA 缓冲液适用于多数磷酸化酪氨酸特异性抗体,而柠檬酸盐缓冲液适用于其他多数抗体。每天都需制备新鲜的 1X 溶液。
抗体:hospho-HER3/ErbB3 (Tyr1289) (D1B5) Rabbit mAb #2842
样本:蜡包埋人类肺部肿瘤
抗原修复缓冲液:柠檬酸盐缓冲液(左)或者 EDTA 缓冲液(右)
煮沸装置
载玻片在所推荐的缓冲液中加热煮沸一段时间后,才可引起抗原修复。该步骤通常在微波炉或高压锅中进行。虽然,一些研究人员也使用水浴锅,但是,因为该步骤中所选择的装置对染色存在积极或消极的影响。所以,我们建议使用微波炉或高压锅加热煮沸以达到最佳抗原修复效果。
抗体:Phospho–Stat3 (Tyr705)(D3A7) XP. Rabbit mAb #9145
样本:石蜡包埋人类肺部肿瘤样本
煮沸设备:浴锅 (左),微波炉 (中),高压锅 (右)
免疫染色—封闭
在 IHC–P 中,我们建议在室温下在含有 Tween20 的 TBST 缓冲液和 5% 正常山羊血清 (NGS) 中封闭样品,时长 1 小时,以防止非特异性背景染色。在进行 IHC–F 时,在含有 0.3% Triton. X–100 的 1X TBS 和 5% NGS 中封闭样品。市售的含有酪蛋白的封闭溶液与磷酸化的一抗结合后易减弱信号;因此,我们建议不使用含有酪蛋白的封闭剂进行磷酸化特异性抗体的检测。以上针对封闭步骤所提建议均是在以 SignalStain. Boost IHC Detection Reagent 作为检测试剂的情况下提出的。如果选择使用其他检测试剂,我们则建议使用与二抗来源相同的血清进行封闭。
抗体:Phospho–Histone H2A.X (Ser139) (20E3) Rabbit mAb #9718
样本:石蜡包埋人类乳腺肿瘤
封闭:含 5% 山羊血清 (NGS) 的 TBST(左)或者基于酪蛋白封闭剂(右)
一抗孵育—抗体稀释液
在 IHC–P 中,有多种抗体稀释液可供选择,但是所选择的抗体稀释剂对染色效果具有显著影响。在 CST,我们利用 SignalStain. 抗体稀释液、TBST/5% NGS(含 5% 山羊血清的 TBST)或者 PBST/5%NGS(含 5% 山羊血清的 PBST) 来稀释一抗。因为合适的稀释剂具有抗体特异性;因此,查阅产品说明书中针对使用的抗体所推荐的稀释剂。在进行 IHC–F 过程中,一抗应在封闭缓冲液 (TBS/0.3%Triton. X–100/5% NGS) 中稀释。
抗体:Phospho–Akt (Ser473) (D9E) XP. Rabbit mAb #4060、Phospho–EGF
Receptor (Tyr1173) (53A5) Rabbit mAb #4407
样本:石蜡包埋人类乳腺肿瘤(上图)和 HCC827 异种移植物(下图)
抗体稀释:SignalStain. 抗体稀释液(左)或 TBST/5%NGS(右)
检测—检测系统
传统的 IHC 检测方法利用了亲和素和生物素间的天然亲和性。这种亲和素–生物素–复合物 (ABC) 系统需要进行两步法检测:包括结合生物素化二抗后暴露于亲和素–HRP 复合物,然后进行显色反应。基于生物素的系统容易导致背景染色,特别是含有大量内源性生物素的肝脏、肾脏等组织。因此,我们建议使用基于聚合物的检测系统,如 SignalStain. Boost IHC 检测试剂。该基于聚合物的检测系统不含生物素,而包含了直接偶联于聚合物主链上的酶和二抗。SignalStain. Boost IHC 检测试剂具有高敏感性并消除因内源性生物素所致的假阳性染色,其检测过程省去一个步骤为检测过程节省了时间,并且其与所有基于过氧化物酶的底物相容。
抗体:Sox2 (D6D9) XP. Rabbit mAb #3579
样本:石蜡包埋的人类肺部肿瘤
检测:基于生物素的检测(左)或基于聚合物的检测(SignalStain. Boost IHC Detection Reagent #8114;(右)
色原
二氨基联苯胺 (DAB) 底物是基于过氧化物酶检测系统中最常用的色原之一。DAB 与 HRP 反应以在抗体结合处形成棕色沉淀物。在实验中建议始终使用高质量的 DAB 底物。在 CST 公司,IHC 小组的 CST 科学家内部鉴定 IHC 抗体所使用的都是 SignalStain. DAB 底物试剂盒。SignalStain. DAB 底物试剂盒敏感性高,且与一抗的作用效果最佳。在 TBST 中清洗 3 x 5 分钟(若为 IHC–F,则在 TBS 中清洗 3 x 5 分钟),以清除未结合的二抗,随后将 100–400μl SignalStain. DAB 应用于每一个组织切片并密切监控以得到合适的显色。一般而言,1–10 分钟即可获得可接受的染色强度。获得合适的染色强度后,将载玻片置于蒸馏水 (dH2O) 中以阻止进一步显色。
抗体:Phospho–Stat3(Tyr705)(D3A7) XP® Rabbit mAb #9145
样本:石蜡包埋的人类乳腺肿瘤
显色检测:利用 SignalStain® DAB Substrate Kit #8059(左),竞争者提供的 DAB(中和右)
CST 的 IHC/IF 明星产品推荐:
生化试剂:
Catalog Number |
Product Name |
Product Type |
Size |
Application |
11932S |
Image-iT® FX Signal Enhancer |
Buffer |
10ml |
IF-P IF-F IF-IC |
12388S |
BackDrop® Green Background Suppressor |
Buffer |
2.5ml |
IF-IC |
14177S |
SignalStain® Mounting Medium |
Buffer |
60ml |
IHC-P |
14746S |
SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) |
Buffer |
125ml |
IHC-P |
14747S |
SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) |
Buffer |
125ml |
IHC-P |
15019S |
Animal-Free Blocking Solution (5X) |
Buffer |
25ml |
W IHC-P |
5425S |
Normal Goat Serum |
Buffer |
10ml |
|
8112S |
SignalStain® Antibody Diluent |
Buffer |
25ml |
IHC-P |
8961S |
ProLong®Gold Antifade Reagent with DAPI |
Buffer |
10ml |
IF-P IF-F IF-IC |
9071S |
ProLong®Gold Antifade Reagent |
Buffer |
10ml |
IF-P IF-F IF-IC |
检测试剂盒:
Catalog Number |
Product Name |
Product Type |
Size |
Application |
8059S |
SignalStain® DAB Substrate Kit |
Detection System Kit |
1Kit |
IHC-P |
12692S |
SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit |
IHC Kit |
1Kit |
IHC-P |
65713T |
PD-L1, CD3ε, CD8α Multiplex IHC Antibody Panel |
IHC Kit |
1Kit |
mIHC |
78701T |
PD-L1, FoxP3, CD8α Multiplex IHC Antibody Panel |
IHC Kit |
1Kit |
mIHC |
8109S |
SignalStain® Proliferation/Apoptosis IHC Sampler Kit |
IHC Kit |
1Kit |
IHC-P |
二抗:
Catalog Number |
Product Name |
Product Type |
Size |
Application |
4408S |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) |
Secondary Antibody |
250µl |
IF-IC F HCA |
4409S |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) |
Secondary Antibody |
250µl |
IF-IC HCA |
4410S |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) |
Secondary Antibody |
250µl |
IF-IC F |
4412S |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) |
Secondary Antibody |
250µl |
IF-IC F |
4413S |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) |
Secondary Antibody |
250µl |
IF-IC HCA |
4414S |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) |
Secondary Antibody |
250µl |
IF-IC F |
4416S |
Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 488 Conjugate) |
Secondary Antibody |
250µl |
IF-IC F |
4417S |
Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 555 Conjugate) |
Secondary Antibody |
250µl |
IF-IC |
4418S |
Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 647 Conjugate) |
Secondary Antibody |
250µl |
IF-IC F |
8114S |
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) |
Secondary Antibody |
15ml |
IHC-P |
8125S |
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) |
Secondary Antibody |
15ml |
IHC-P |
8889S |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) |
Secondary Antibody |
250µl |
IF-IC F |
8890S |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) |
Secondary Antibody |
250µl |
IF-IC F |
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