关键词: ELISA 常见问题 可能原因
来源: 笃玛
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ELISA 试验以灵敏度较高、特异性较好的特点得到了广泛的应用,但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大,如不注意,有可能导致显色不全、花板等结果。我公司将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下,以期提高试验质量。Elisa 试验操作中可能影响结果的原因及其相应的解决办法1 选择试剂 选择质量优良的检测试剂,严格按照试剂说明书进行操作,操作前将试剂在室温下平衡至少 30 分钟。2 加样 可能原因:1)血清或血浆标本分离不好即进行加样;2)手工操作中,加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长 (特别是室内温度较高时);3)加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。解决办法:1) 标本为血清:将血液先自然存放 1-2 小时后,再用 3000rmp 离心 15 分钟;标本为血浆:必须使用含抗凝剂的血液标本收集管,采血后必须立即颠倒采血管混合 5-10 次,放置一段时间后,3000rpm 离心 15 分钟;若在几天内检测,可放在 2-8℃ 冰箱中,若要贮存,则置于-20℃ 的低温冰箱内。2) 加样后及时放入孵箱。3) 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。4) 如果采用 AT 或其他全自动加样,最好选择 FAME 或其他后处理仪器加酶试剂。5) 标本较多时,请分批操作。3 孵育可能原因:1) 孵育时未贴封片或加盖,使标本或稀释液蒸发,吸附于孔壁,难于清洗彻底;2) 孵育时间人为延长,导致非特异性结合紧附于反应孔周围,难以清洗彻底。解决办法:1) 贴封片或加盖;2) 按说明步骤严格控制操作时间。4 洗板 可能原因:1) 采用手工洗板, 孔与孔之间液体交叉。2) 采用半自动洗板机洗板时,洗液量不足,导致洗板不彻底;洗板针堵塞,抽吸不完全;洗板不畅,导致洗板效果差。3) 反应板过多造成洗板等待时间长。解决办法:1) 保证洗液注满各孔,洗板针畅通,洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干;2) 合理安排,或多用几台洗板机。5 显色 可能原因:1) 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂;2) 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。解决办法:1) 显色剂尽量在临用前配制,坚持不用过期显色剂,肉眼可见浅蓝色的 TMB 显色剂不用;2) 加样时保持显色剂不外流;3) A、B 液应避免接触金属器械。6 终止 可能原因如加终止液时产生较多气泡,导致假阳性增加。所以在加终止液时应避免产生气泡。7 读板 如读板时板底不清洁等。应保证酶标板清洁。在整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸;尽可能实现 ELISA 检测标准自动化,有效提高检测质量。在实际操作中,除了选择优良试剂外,必须严格按照操作步骤进行操作,同时做好室内质控、室间质评,以严谨的工作作风检测每一份标本,才能保证检测质量。
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