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各种染色方法大荟萃

关键词: 多种染色方法 总结 2015-07-03 16:53 来源:丁香园论坛 点击次数:8665

A

AgNOR 染色法:

1、试剂配制:

(1)AgNOR 染色液:

甲液:明胶 2 g 溶于双蒸水至 99 ml,在 60℃ 使之完全溶解,再加入纯甲酸 1 ml 摇匀待用。

乙液:硝酸银 50 g 溶解于双蒸水中至 100 ml,4℃ 冰箱保存。

(2)AgNOR 工作液

取甲液 10 ml,乙液 20 ml 临用前混合。

2、步骤:

(1)切片脱蜡至水

(2)双蒸水洗 2 次

(3)AgNOR 工作液中(25℃)浸染 30 分钟(暗处进行)(镜下观察)

(4)双蒸水洗 3 次

(5)脱水, 透明, 封固

3、结果:油镜观察,细胞核及胞质背景为淡黄色, AgNOR 呈棕黑色颗粒状。

B

鞭毛染色法:

1.试剂配制:

甲液:丹宁酸 5克,氯化铁(FeCl3)1.5克,福尔马林(15%)2.0毫升,氢氧化钠(NaOH)1% 1.0毫升

乙液:硝酸银(AgNO3)2克

蒸馏水 100 毫升

制备乙液时,待硝酸银溶解后,取出10毫升备用,向余下的90毫升硝酸银液中滴加浓氢氧化铵,先呈很浓厚的沉淀,再继续滴加至刚刚溶解沉淀成澄清液为止。再将备用的硝酸银溶液慢慢逐滴加入澄清液中,先呈现薄雾,但轻摇则消失,继续边滴加边摇动,待澄清液呈现略有轻微不消散的薄雾状为止。如雾重,则银盐沉淀,不宜使用。

2.染色方法:

(1)将待检菌接种在新制备的肉汤琼脂斜面上,置37°培养16—20小时,备用。

(2)在载玻片的中部相隔一厘米处,用接种环各沾一滴蒸馏水,然后用接种环挑取湿润处的菌苔少许于一端的水滴中,倾斜玻片使培养物流至另一水滴中,两水滴自然相通,菌体从上位自然扩散到下位水滴中,待干燥后染色。

(3)在干燥涂片上加甲液3—5分钟,用蒸馏水冲洗。将残水沥干或用乙液冲去残水后,加适量乙液保持30—60秒钟。染色时在酒精灯上稍加热,使染液出现蒸汽即可,用蒸馏水冲洗。

(4)镜检:菌体及鞭毛皆染成茶色。

3.注意事项:

(1)染液最好随用随配,存放至次日效果则差。

(2)一定要充分洗净甲液后再加乙液,否则背景较脏。

(3)防止水及培养物沾有氯化物。

(4)切忌用接种环涂抹培养物。

(5)载玻片一定要洗净。先用洗衣粉煮沸,再水洗,干后放在洗液中,浸泡 24 小时,取出水洗除去残酸,沥干,存放于95% 乙醇中备用。

(6)加热时最好置金属板上,使载玻片受热均匀。

β-半乳糖苷酶可以催化二糖乳糖水解为单糖:葡萄糖和半乳糖。

β-半乳糖苷酶的活性可以用 X-gal(5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)等显色底物加以检测,β-半乳糖苷酶可将 X-gal 转变为不溶性的深蓝色沉淀。

X-gal 可以做为组织染色剂,可以在所有表达β-半乳糖苷酶的植物和动物组织上产生颜色。

应该是可以用来病毒感染组织切片染色的。

C

CAE 染色步骤

1、试剂配制:

(1)A 液:萘酚-AS—D 氯醋酸 10 mg 溶于 N,N-二甲基甲酰胺 1 ml 中。

(2)4% 副品红液:取盐酸副品红 (EM 级)1 g,溶于蒸馏水 20 ml 内,再加入 10m1/L 的 HCl 5m1,稍加温以增加溶解度,过滤、贮室温下。于使用前,取等量副品红液与新鲜的 4% 亚硝酸钠混合,之后用淀粉碘化物试纸测试,瞬间试纸应变为蓝色才合格,如果不变色,应加入更多的亚硝酸盐。

(3)B 液:o.1mol/L 的 Michaelis Veronal-醋酸缓冲液 (PH 7.6)30 ml,加入新配制的副品红液 3 滴,用 1moI/L HCl 使 PH 值调至 6.3。

2、染色步骤:

(1)将 A.、B 二液混合,过滤,加入氟化钠 (17 mg/10 ml), 使之最后浓度为 0.04mol/L.

(2)切片置于上述溶液内孵育 1 h(30℃)

(3)流水冲洗。

(4)苏木素复染。

(5)空气干燥后封固。

G

Grimelius 硝酸银反应法(嗜银反应):

1、试剂配制:

硝酸银液: 1% 硝酸银水溶液 3 毫升 蒸馏水 87 毫升

0.2M 醋酸缓冲液 (PH5.6) 10 毫升

还原液: 对苯二酚 1 克 亚硫酸钠 5 克 蒸馏水 100 毫升

2、染色步骤:

(1)切片脱蜡至蒸馏水

(2)60℃ 硝酸银液内 3 小时

(3)用滤纸吸去周围银液, 蒸馏水速洗

(4)入 45℃ 的还原液处理 1 分钟

(5)蒸馏水洗

(6)5% 硫代硫酸钠处理 1 分钟 (可不做)

(7)水洗, 脱水, 透明, 封固

3、结果:嗜银颗粒呈棕黑色。正常时嗜银颗粒存在于神经内分泌细胞,故此法主要用于神经内分泌肿瘤的诊断。

H

HID 染色法

1、染色步骤:

(1)切片脱蜡至蒸馏水

(2)放入预热的 1 当量盐酸中 10 分钟

(3)蒸馏水洗

(4)Schiff 液中染 10 分钟

(5)自来水洗 15 分钟至细胞核红色(如 2~5 步不做,可在染好爱先蓝后染核固红 2 分钟)

(6)蒸馏水洗

(7)高铁二胺液 18~24 小时

(8)爱先蓝液 (pH2.5) 染 10~20 分钟

(9)蒸馏水洗

(10)脱水, 透明, 封固

2、结果: 硫酸化酸性粘液呈棕黑色, 羧基化酸性粘液(唾酸粘液)物质蓝色。硫酸化酸性粘液可见于大肠粘膜,而小肠粘膜仅出现唾酸粘液,此法多用于确定肠化的分型。

HP(硝酸银法)

1、试剂配制:

(1)醋酸缓冲贮备液,PH3.6

0.2N 醋酸缓冲液,PH3.6 10 ml

蒸馏水 240 ml

以下各液均用此液配制

(2)1 % 硝酸银液

硝酸银 1 g

醋酸缓冲贮备液,PH3.6 100 ml

(3)2 % 硝酸银液

硝酸银 0.2 g

醋酸缓冲贮备液,PH3.6 10 ml

(4)5 % 明胶液

明胶 5 g

醋酸缓冲贮备液,PH3.6 100 ml

先把醋酸缓冲贮备液加温至 40℃ 左右,然后倾入明胶,于 37℃ 温箱内慢慢溶解,搅拌。

(5)3 % 对苯二酚液

对苯二酚 0.3 g

醋酸缓冲贮备液,PH3.6 10 ml

(6)明胶对苯二酚液

3 % 对苯二酚液 1 ml

5 % 明胶液 15 ml

(7)显影液

明胶对苯二酚液 16 ml

2 % 硝酸银液 3 ml

在操作到第 4 步完成前 5 分钟充分混合,置于 56℃ 水浴箱中保温待用。

2、操作方法:

(1)组织脱蜡至蒸馏水

(2)醋酸缓冲贮备液洗 2 次

(3)入 1 % 硝酸银液中,56℃,1 小时

(4)切片不水洗,直接放入预热的显影液中 56℃,肉眼呈黄棕色为止。

(5)倾去显影液,于 56℃ 的水中浸洗 2 分钟

(6)水洗

(7)脱水,透明,封固。

3、结果:幽门弯曲菌呈棕黑至黑色。

Highman 甲醇刚果红染色法(类淀粉染色)

1、试剂配制:

甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml

碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.2 g 80% 乙醇 100 ml

2、染色步骤:

(1)切片脱蜡至水

(2)甲醇刚果红染液染 10~20 分钟

(3)用碱性乙醇分化液分化数秒

(4)水洗

(5)苏木素复染 2 分钟

(6)水洗

(7)脱水, 透明, 封固

3、结果:淀粉样物呈桔红色。

4、类淀粉染色的应用:

确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织,后者在刚果红法染色后呈淡桔色,常用于诊断甲状腺髓样癌和胰岛细胞瘤等。

L

六胺银染色法

1、试剂配制:

六胺银液配制:

3% 六次甲基四胺水溶液 5 ml

2.5% 硝酸银水溶液 0.5 ml

摇晃,变清,再加 2.5% 四硼酸钠 1.5~2 ml 加蒸馏水至 30~40 ml

2、步骤:

(1)切片脱蜡至水,蒸馏水洗

(2)0.5% 高碘酸浸 15 分钟,蒸馏水洗

(3)六胺银液 60℃,1-2 小时,(或六胺银液 80-90℃,半小时左右)蒸馏水洗(镜下基底膜呈黑色)

(4)0.2% 氯化金调色数秒

(5)丽春红淡染

(6)水速洗

(7)烘干,透明,封片。

3、结果:肾小球基底膜呈黑色,霉菌,弹力纤维及一些网状纤维也呈黑色。

M

Mallory 三色法

1、步骤

(1)切片脱蜡至水

(2)0.5% 酸性复红水溶液 1 min

(3)蒸馏水洗

(4)入下液 1-2 min

苯胺蓝 0.5 g,桔黄 G 2 g,磷目酸或磷钨酸 1 g,蒸馏水 100 ml。

(5)蒸馏水洗

(6)95% 乙醇分色

(7)脱水,透明,封片。

2、结果:胶原纤维蓝色, 红细胞桔黄色,核红色。

Mallory 磷钨酸~苏木素染色法(PTAH)

1、试剂配制:

苏木素 0.1 g 磷钨酸 2.0 g 蒸馏水 100 ml

先将苏木素加热溶于 20 毫升蒸馏水, 再将磷钨酸溶于 80 毫升蒸馏水。等苏木素冷却后,加入磷钨酸溶液,混合,放置数星期后,才可使用。如急用,可加入 0.2 g 高锰酸钾, 加速其成熟。

2、染色步骤:

(1)切片脱蜡至蒸馏水。

(2)放入 0.25% 高锰酸钾水溶液 5 分钟。

(3)蒸馏水洗。

(4)2.5% 草酸漂白 5 分钟。

(5)蒸馏水洗多次。

(6)置于磷钨酸苏木素溶液 12~24 小时。

(7)95% 酒精快速分化,滤纸吸去剩余酒精,置 60℃ 温箱中烘干。

(8)二甲苯透明,封固。

3、结果:纤维胶质,肌胶质,神经胶纤维,纤维素,横纹肌等均染成蓝色。胶原,网状纤维和骨基质着黄色或砖红色。在工作中常用于观察横纹以证实肿瘤细胞是否有横纹肌分化特征。

Masson 三色染色法

1、试剂配制:

丽春红酸性品红液: 丽春红 0.7 g 酸性品红 0.3 g

蒸馏水 99 ml 冰醋酸 1 ml

苯胺蓝液: 苯胺蓝 2 g 蒸馏水 98 ml 醋酸 2 ml

亮绿液: 亮绿 0.2 g 蒸馏水 100 ml 冰醋酸 0.2 ml

苦味酸酒精液: 苦味酸在 95% 酒精中的饱和液 20 ml, 加 95% 酒精 10 ml

2、染色步骤:

(1)切片脱蜡至蒸馏水

(2)苏木素染 5~10 分钟

(3)盐酸酒精分化

(4)流水蓝化,蒸馏水洗 (苏木素可不染)

(5)丽春红酸性品红液中染 5~8 分钟

(6)蒸馏水洗

(7)1% 磷钼酸中染 1~3 分钟

(8)不用水洗直接入苯胺蓝液或亮绿液 5 分钟 (如染色效果不佳, 可在冰醋酸内脱色后重染)

(9)水速洗,置 60℃ 温箱中烘干,二甲苯透明, 封固

3、结果: 胶原纤维蓝色(苯胺蓝复染)或绿色(亮绿复染), 肌纤维、纤维素红色。

4、注意:

(1)此法广泛用于胶原纤维和平滑肌的鉴别,也为肾组织活检,观察肾小球病变的重要染色法,常用于观察缺血病变的心肌。 用于观察肾小球病变时,一定要用 2um 以下半薄切片。

(2)细胞核染色后分化很重要,观察控制着色程度。而 HE 染色则是最常用的一种常规染色方法,但无法区别胶原纤维和肌肉。

N

粘液染色

(一)PAS 染色法

与染糖元的方法相同。

(二)AB(pH2.5) 染色法

1、试剂配制:

爱先蓝 8 GX 1 g 蒸馏水 97 ml 冰醋酸 3 ml

核固红液: 核固红 0.1 g 硫酸铝 5 g 麝香草酚 50 mg 蒸馏水 97 ml

2、染色步骤:

(1)切片脱蜡至蒸馏水。

(2)爱先蓝液染 10~20 分钟

(3)蒸馏水洗

(4)核复染 (核固红 5 分钟),水洗

(5)脱水, 透明, 封固。

唾液酸及弱硫酸化粘液及一般粘液呈蓝色。常用于确定胞浆内空泡的性质,特别是当细胞呈现印戒样特征时。

J

甲基绿派洛宁法(改良 Cook,1974)

1、试剂配制:

(1)2% 甲基绿水溶液:

甲基绿(methyl green)1 g

蒸馏水加至 50 ml

用三氯甲烷抽提,方法详后。

(2)5% 派洛宁水溶液:

派洛宁 G(pyronine G)1 g

蒸馏水加至 20 ml

(3)0.2M 醋酸盐缓冲液(pH 4.8)

0.2M 醋酸液 41 ml

0.2M 醋酸钠液 59 ml

(4)甲基绿派洛宁染液:

2% 甲基绿水溶液(经抽提)5 ml

5% 派洛宁水溶液 1 ml

蒸馏水 12 ml

0.2M 醋酸盐缓冲液(pH 4.8)18 ml

甲基绿水溶液的抽提:甲基绿为绿色粉末,属三苯甲烷染料,这种染料是由氯代甲烷作用于结果晶紫而形成的一种化合物。由于甲基化作用,甲基绿就比甲基绿后,所引进的甲基连接得并不牢固,容易从甲基绿中脱失。另一方面,在甲基化过程中,还有一部分结晶紫并没有生成甲基绿,因此,也有人认为甲中,常有少量的甲基紫或结晶紫成份。但是,也有人认为甲基紫乃是甲基绿的衰败产物,甲基绿在储存过程中,会不断产生甲基紫。因此,在配制试剂时,必须先将甲基绿所含的甲基紫或结晶紫抽提出来,才能使细胞核内的脱氧核糖核酸染成绿色。抽提方法是取 2% 甲基绿水溶液 20 ml 倾入洁净分液漏斗,加入三氯甲烷 20 ml 充分摇荡混合,使其内的甲基紫溶于三氯甲烷中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞,慢慢把如此反复更换三氯甲烷,直到三氯甲烷无紫红色为止,即可得到得纯的甲基绿溶液。

2、操作步骤:

(1)新鲜组织固定于 Carnoy 氏液(4℃)3~6 小时,经 95% 酒精和无水酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。

(2)切片经二甲苯脱蜡至蒸馏水。

(3)置入甲基绿派洛宁染液于室温染 30~60 分钟。

(4)取出切片,不经水洗,用滤纸吸干多余染液。

(5)用丙酮迅速分化。

(6)转入丙酮二甲苯(1:1)稍洗。

(7)二甲苯透明 2~3 次。

(8)中性树胶封固。结果:存在于胞质和核仁内的核糖核酸呈红紫色,胞核染色质内的脱氧核糖核酸绿色或绿蓝色。

3、对照方法:

(1)取另一连续切片用核糖核酸酶(rihonuclease)1 mg/1 ml 于 37℃ 温箱内消化 3 小时,蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色。

(2)切片在 10% 高氯酸(prechloric acid)于 4℃ 处理 12~18 小时,水洗后用 1% 碳酸钠液中和 2 分钟,流水冲洗 5 分钟,再用蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色。经上述方法之一处理后的切片就为阴性。

4、注意事项:

(1)组织不宜用甲醛固定,应选用 Garnoy 氏固定液,因为酒精和醋酸能较好地保存核蛋白。

(2)Garnoy 氏液固定标本的时间不宜太长,超过一天则染色效果不理想。

(3)要注意试剂的质量,特别是派洛宁,常常不同批号的染料,染色的效果不同。甲基绿和派洛宁二者的比例要恰当。

(4)染色液的 pH 应为 4.8 左右,如 pH 过低,甲基绿染色效果差;pH 偏高,则派洛宁染色效果不良。

(5)丙酮分化时间要很好掌握,时间不宜太长。

(6)配妥的甲基绿派洛宁染液用后放冰箱保存,约可使用数周。

染色原理:对此法的染色原理,目前了解得还不够清楚,一般可从下面两方面理解。

(a)电离作用:脱氧核糖核酸和核糖核酸都有磷酸基,又有碱基,故为两性电解质。在一定的条件下,可以电离而带电荷,因此都有一定的等电点。甲基绿和派洛宁在水中电离后,都产生带阳电荷的离子。甲基绿电离后,在五价氮处产生二个正电荷,碱性较强。派洛宁电离后仅产生一个正电荷,碱性较甲基绿弱,在染色时二者进行竞争,碱性较强的甲基绿就与胞核(等电点 pH3.8~4.2)进行极性吸着而结合,碱性较弱的派洛宁与胞质(等电点 pH4.6~5.2)吸附结合。

(b)聚合作用:甲基绿对聚合高的 DNA 有亲和力,派洛宁对聚合低的 RNA 有亲和力。因此,思虑在绿选染 DNA,而派洛宁选染 RNA。应用:PNA 主要存在于胞质及核仁内,它主导细胞的蛋白质合成。在细胞增生,胞质蛋白质合成亢进时,核仁和胞质的 PNA 增加。因此,恶性瘤细胞核仁巨大,胞质嗜碱。浆细胞和免疫母细胞胞质合成免疫球蛋白,胰腺上皮合成胰蛋白酶。因此,这些细胞胞质有很强的嗜碱性。胞质嗜碱,是蛋白质合成增强的标志。

S

脂肪(苏旦Ⅲ)法

1、试剂配制:

苏旦Ⅲ 0.1~0.2 70% 酒精 100 ml

将苏旦Ⅲ置于 70% 酒精中, 加热饱和, 在未冷前过滤, 静置一夜。

2、染色步骤:

(1)冰冻切片(8~10 微米)。

(2)70% 酒精固定 1 分钟。

(3)放入苏旦Ⅲ酒精溶液中 20~30 分钟。

(4)70% 酒精洗去多余的染料。

(5)水洗。

(6)苏木素复染 2~5 分钟。

(7)1% 盐酸酒精分化。

(8)水洗,蓝化, 甘油封固。

3、结果:脂肪桔黄或红色。一般用于确定胞浆内空泡究竟是糖原,水变性还是脂滴。

P

高碘酸-六胺银-马休黄染色法 (PASM-M)

1、试剂配制:

六胺银原液: 3 % 六甲基四胺水溶液 (乌洛托品) 20 毫升,5 % 硝酸银水溶液 10 毫升。

六胺银工作液:六胺银原液 30 毫升,双蒸水 20 毫升,5 % 硼砂 (四硼酸钠)2 毫升。

核固红液:核固红 0.1 克,5 % 硫酸铝 100 毫升加热溶解,贮存饱和液待用。

马休黄液:马体黄 0.5 克,无水酒精 98 毫升,磷酸 0.2 克。

2、操作方法:

(1)常规脱蜡至水

(2)0.5% 氧化 20 分钟

(3)蒸馏水洗 3 次

(4)浸入六胺银工作液中 2 小时左右 (恒温 58℃)

(5)蒸馏水洗 3 次

(6)0.2% 氯化金 1-2 分钟

(7)蒸馏水洗 2 次

(8)核固红染色 10-15 分钟

(9)马休黄染色 1 分钟

(10)放入温箱烤干,二甲苯透明,中性树胶封固

3、结果:肾小球毛细血管基膜呈黑色,背景和红细胞呈黄色,细胞核呈红色。

4、注意:

(1)六胺银工作液现配现用,只能用一次。

(2)第 3 步做完后可入 5 % 三氧化铬 (铬酸) 水溶液氧化 40 分钟,再用 1 % 亚硫酸钠除铬,背景可能效果更佳。

(3)马休黄主要是染红细胞。用无水酒精中脱水,黄色的背景就脱掉,可直接放入温箱或电吹风吹干,封片。

R

瑞氏-姬姆萨染色方法

1、试剂配制:

原料:

A: 瑞氏染粉 0.8--1 克;吉姆萨染粉 0.5 克

B: 甘油 33 ml

C:甲醇 500 ml

配法:将 A 放入研钵中,加入少量 B 研磨,再加入少量 B 磨,再加入少量 B 磨……倒出,将未溶部分,继续加入 B 磨……> 全溶,加入 C,或中间加入 C 亦可。

2、染色步骤:

滴数滴入玻片盖满标本,30 秒,再加入双蒸水或 PBS2-3 倍染 1-3 分中,倾去染液,水洗……封片。

T

Trypan blue(台盘兰)排斥实验:

细胞悬液 0.1 ml 加入 0.4% Trypan blue 生理盐水溶液 0.1 ml, 混匀后滴在血球记数板上。存活率 = 不着色细胞数/细胞总数 X100%

TTC 方法:

TTC 和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应,生成红色的甲月赞,用来表示细胞的活力。配制多为 2%,染色要避光,37 度条件下,它是评价脑缺血损伤常用的指标。

V

Van Gieson 法

1、试剂配制:

(1)饱和苦味酸水溶液(约 1.22%)150 ml

(2)1% 酸性品红 10 ml

(3)上述两种溶液用前混合在一起。

2、染色步骤:

(1)切片脱蜡至蒸馏水。

(2)苏木素深染。(10~15 分钟)

(3)Van Gieson 中染半分钟。

(4)蒸馏水洗。

(5)置 60℃ 温箱中烘干。

(6)二甲苯透明,封固。

3、结果:胶原纤维红色,肌纤维、胞浆、红细胞黄色。

4、建议:用稀释的 Van Gieson 液进行染色,不用 95% 的酒精分化,结果色泽鲜艳,而且着色均匀。

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编辑: wudihero007
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